jména:

obor:

datum provedení:

neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu

A B C D E F G H (zakroužkujte)

neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu

a b c d e f g h (zakroužkujte)

přílohy protokolu: chromatogram, graf (kalibrační přímka pro stanovení redukujících sacharidů
Somogyiho metodou)

OKRUHY K PŘÍPRAVĚ

Struktura sacharidů (monosacharidy vs. disacharidy vs. trisacharidy vs. polysacharidy). Struktura
monosacharidů (pentosy vs. hexosy, aldosy vs. ketosy). Struktura disacharidů a trisacharidů
(monosacharidové podjednotky a jejich vzájemné vazby). Redukující vs. neredukující oligosacharidy.
Barevné reakce sacharidů. Princip rozdělovací chromatografie. Retenční faktor. Lambert-Beerův
zákon. Glukosaoxidasová reakce a princip stanovení koncentrace glukosy enzymovou elektrodou.
Chemické výpočty.

Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a
sedmihodinová cvičení).

Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): jen části A, B.

Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): jen části A, B.

PRINCIP ÚLOHY

A. Barevné reakce sacharidů

Chemické reakce sacharidů jsou založeny na jejich schopnosti tvořit dehydratací minerálními
kyselinami furan-2-aldehyd nebo jeho deriváty a dále na reaktivitě hydroxylových a karbonylových
skupin sacharidů. Některé polysacharidy tvoří barevné klathráty s jódem. Volbou vhodné kombinace
kvalitativních reakcí lze určit základní charakteristiky neznámého vzorku. Barevné reakce sacharidů
lze dále využít např. pro jejich kvantitativní fotometrické stanovení, pro jejich chromatografickou
detekci, případně pro identifikaci cukerných složek biopolymerů.

1. Reakce založené na tvorbě furan-2-aldehydu a jeho derivátů

Monosacharidy jsou účinkem minerální kyseliny dehydratovány na furan-2-aldehyd (označovaný také
jako furfural – týká se pentos) nebo 5-hydroxymethylfuran-2-aldehyd (týká se hexos).
Furan-2-aldehyd nebo 5-hydroxymethylfuran-2-aldehyd kondenzuje s fenoly nebo aromatickými aminy
(thymol, 1-naftol, orcin, resorcin, difenylamin a jiné) za vzniku barevných derivátů, které jsou
obdobou trifenylmethanových barviv. Různé sacharidy poskytují v různých reakčních prostředích různě
zbarvené produkty. Volbou reakčního prostředí proto získáváme reakce s různou specifitou. Pro
kvalitativní určení sacharidu v neznámém vzorku se v této úloze využije:

- Thymolova reakce, která poskytuje barevný produkt se všemi sacharidy.

- Selivanova a Rothenfusserova reakce, poskytující specifické zbarvení pro všechny ketosy.

- Bialova reakce, poskytující specifické zbarvení pro všechny pentosy.

Barevné reakce mohou poskytovat i oligosacharidy, polysacharidy nebo glykosidy, pokud při
podmínkách stanovení dochází k jejich hydrolýze.

2. Redoxní reakce

Redoxní reakce sacharidů jsou založeny na oxidaci volné karbonylové funkční skupiny sousedící
s hydroxylovou skupinou (α-ketol). Aldehydická skupina aldos se přitom oxiduje na karboxylovou,
zatímco u ketos dochází k oxidaci ketoskupiny spojené se štěpením molekuly sacharidu.
Oligosacharidy, které nemají volnou karbonylovou skupinu (resp. volný hemiacetalový hydroxyl),
barevnou reakci neposkytují. K nejpoužívanějším oxidačním činidlům patří oxid měďnatý (Fehlingova a
Somogyiho reakce), soli stříbra, antimonu nebo bismutu a kyselina pikrová.

3. Reakce s jódem

Pokud má polysacharid šroubovicové uspořádání, pronikají molekuly I[2] do dutin vytvořených
šroubovicí a vzniklý klathrát se vyznačuje změnou fyzikální vlastnosti (změna zbarvení). Řetězce
tvořené 30–35 monosacharidovými podjednotkami poskytují modré zbarvení, řetězce tvořené 8–12
monosacharidovými podjednotkami poskytují červené zbarvení, kratší řetězce zbarvení neposkytují.

B. Rozdělovací chromatografie sacharidů

Základem všech chromatografických metod je distribuce analyzovaných látek mezi stacionární a
mobilní fází na základě rozdílné interakce analyzovaných látek s těmito fázemi.

Při rozdělovací chromatografii se jako stacionární a mobilní fáze používají dvě navzájem
nemísitelná nebo omezeně mísitelná rozpouštědla. Aby bylo možno docílit vzájemného pohybu dvou
nemísitelných fází, je nutno jednu z nich zakotvit (stacionární fáze). Stacionární fází bývá
obvykle voda, zakotvená na hydrofilním nosiči (silikagel, škrob, celulosa apod.). Mobilní fází je
méně polární organické rozpouštědlo, zpravidla směs rozpouštědel s určitým rovnovážným obsahem
vody, která je nutná k tomu, aby při eluci nedocházelo k vymývání stacionární vody z nosiče. Pokud
se jedná o tzv. chromatografii s reverzní fází, ukotvuje se naopak nepolární rozpouštědlo na
hydrofobním nosiči.

Při rozdělovací chromatografii v plošném uspořádání se látky nanesou na plochu nosiče s ukotvenou
stacionární fází, přes kterou protéká mobilní fáze. Látky více rozpustné ve stacionární fázi se
pohybují pomaleji, zatímco látky rozpustnější v mobilní fázi se pohybují rychleji. Rychlost pohybu
látek je charakterizována retenčním faktorem (R[f]), který je definován jako podíl vzdálenosti
analytu od startu a vzdálenosti čela rozpouštědla od startu. Teoreticky může R[f] dosahovat hodnot
od 0 (látka se při chromatografii nepohybuje, zůstává na startu) do 1 (látka putuje současně
s čelem mobilní fáze). Optimálně má být R[f] v rozmezí 0,15 – 0,8. Jakmile dojde čelo rozpouštědla
k okraji plochy nosiče, proces se ukončí, chromatogram se vysuší a jednotlivé látky, nejsou-li
barevné, se detekují nejčastěji vybarvením skvrn látek pomocí chemických činidel. Někdy je možné
pozorovat skvrny v ultrafialovém světle, radioaktivní látky lze lokalizovat měřením radioaktivity
apod.

V této úloze bude k identifikaci neznámého vzorku sacharidu použita rozdělovací chromatografie
v plošném uspořádání na tenké vrstvě silikagelu (Silufol). Stacionární fáze je polární a tvoří ji
voda vázaná v silikagelu, mobilní fáze je méně polární a tvoří ji směs ethylacetátu, isopropanolu a
vody. Pohyblivost sacharidů je při rozdělovací chromatografii ovlivněna především velikostí
molekuly (počet monosacharidových podjednotek – monosacharidy vs. oligosacharidy) a počtem uhlíků
v molekule (pentosy vs. hexosy), dále prostorovým uspořádáním hydroxylových skupin (rozlišení
epimerů) a jejich počtem (sacharid vs. deoxysacharid). Vliv na pohyblivost sacharidů má dále
charakter cyklické struktury (furanosy jsou pohyblivější než pyranosy), u oligosacharidů se
uplatňuje i způsob spojení podjednotek (1,4-disacharidy jsou pohyblivější než 1,6-disacharidy).
Detekce sacharidů na chromatogramu bude provedena jejich reakcí s hydrogenftalátem anilinu.
Aldopentosy poskytují s touto látkou po zahřátí v kyselém prostředí intenzivní zbarvení odlišného
odstínu než aldohexosy, a ketosy se barví slaběji. Redukující oligosacharidy rovněž poskytují
zbarvení, neredukující oligosacharidy zbarvení neposkytují a nelze je touto metodou identifikovat.

C. Stanovení koncentrace redukujících sacharidů Somogyiho metodou

Sacharidy obsahující volnou hemiacetalovou hydroxylovou skupinu redukují v alkalickém prostředí za
zvýšené teploty (100 ^oC) komplexní měďnatou sůl (vytvořenou při smíchání Somogyi-Nelsonova činidla
I a II) za vzniku měďných iontů, které dále redukují arsenomolybdenan (součást Somogyi-Nelsonova
činidla III) na molybdenovou modř. Ta je barevným reakčním produktem s absorpčním maximem při
vlnové délce 740 nm, jehož koncentraci lze stanovit fotometricky. Intenzita modrého zbarvení je
tedy přímo úměrná koncentraci redukujících sacharidů. Při nízkých koncentracích redukujících
sacharidů ve vzorku je výsledné zbarvení modrozelené nebo trávově zelené. Metoda je velmi citlivá:
je vhodná pro vzorky obsahující velmi malá látková množství redukujících sacharidů (řádově 0,1
μmol). Na druhé straně však jakékoliv nečistoty redukujících látek ve zkumavkách a pipetách falešně
pozitivně ovlivňují získané výsledky.

PRAKTICKÁ ČÁST A. Barevné reakce sacharidů

Materiál a vybavení:

1% roztoky sacharidů (standardní vzorky): arabinosa (ara), ribosa (rib), glukosa (glc), galaktosa
(gal), fruktosa (fru), sacharosa (sac), trehalosa (tre), maltosa (mal), škrob (škr), glykogen (gly)

neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu (obsahuje jeden z výše uvedených sacharidů) (?)

koncentrovaná kyselina chlorovodíková

3% roztok thymolu v ethanolu

Selivanovo činidlo (roztok resorcinu v kyselině chlorovodíkové)

Rothenfusserovo činidlo (roztok difenylaminu v ethanolu, kyselině octové a chlorovodíkové)

Bialovo činidlo (roztok orcinu a chloridu železitého v kyselině chlorovodíkové)

Fehlingovo činidlo I (roztok síranu měďnatého)

Fehlingovo činidlo II (roztok vínanu sodno-draselného v hydroxidu sodném)

Somogyi-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, síranu sodného a vínanu sodno-draselného)

Somogyi-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného)

Somogyi-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a arseničnanu sodného v kyselině sírové)

Lugolův roztok (roztok jódu a jodidu draselného)

zkumavky, Pasteurovy pipety, kahan a trojnožka nebo vařič, držák na zkumavky, hrnec, kruhový stojan
na zkumavky

Postup:

Reakce proveďte s roztoky známých sacharidů a s neznámým vzorkem podle rozpisu v tabulce na
následující straně. Reakce v tmavě vyznačených polích tabulky vynechejte. Vznik barevných produktů,
případně sraženin, popište do tabulky v řádku „popis“. Je-li zbarvení vzorku příliš intenzivní,
tak, že nelze rozeznat jeho odstín, zřeďte vzorek vodou. Na základě znalosti specifity reakce,
struktury a chemických vlastností sacharidu rozhodněte, zda je výsledek reakce pro daný sacharid
pozitivní (+) nebo negativní (-). Totéž rozhodněte v případě neznámého vzorku, a to na základě
podobnosti zbarvení. Výsledky zapište do tabulky.

Roztoky činidel nepipetujte ani nepoužívejte dávkovače – odměřujte pomocí plastových Pasteurových
pipet („kapátek“)!

Thymolová reakce (reakce na přítomnost sacharidu): smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu, 3 kapky
roztoku thymolu a 3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Opatrně povařte 1 – 5 minut.

Selivanova reakce (reakce na přítomnost ketosy): smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml
Selivanova činidla. Zahřívejte 1 minutu ve vroucí vodní lázni.

Rothenfusserova reakce (reakce na přítomnost ketosy): smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml
Rothenfusserova činidla. Zahřívejte 10 minut ve vroucí vodní lázni.

Bialova reakce (reakce na přítomnost pentosy): smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml Bialova
činidla. Zahřívejte 5 minut ve vroucí vodní lázni.

Fehlingova reakce (reakce na přítomnost redukujícího sacharidu): smíchejte 0,5 ml roztoku
sacharidu, 0,5 ml Fehlingova činidla I a 0,5 ml Fehlingova činidla II. Opatrně povařte.

Somogyiho reakce (reakce na přítomnost redukujícího sacharidu): smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu,
0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla I a 0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla II. Zahřívejte 10 minut ve
vroucí vodní lázni. Po zchladnutí přidejte 2 ml Somogyi-Nelsonova činidla III.

Reakce s jódem (reakce na přítomnost polysacharidu): 0,5 ml roztoku sacharidu smíchejte s kapkou
Lugolova roztoku.

ara

rib

glc

gal

fru

sac

mal

tre

gly*

škr

reakce na přítomnost sacharidu

Thymolová

popis

+/-

reakce na přítomnost ketosy

Selivanova

popis

+/-

Rothenfusserova

popis

+/-

reakce na přítomnost pentosy

Bialova

popis

+/-

reakce na přítomnost redukujícího sacharidu

Fehlingova

popis

+/-

Somogyiho

popis

+/-

reakce na přítomnost polysacharidu

S jódem

popis

+/-

*glykogen – jen pokud je k dispozici

Vyhodnocení:

Předběžně identifikujte neznámý sacharid na základě informací, které jste získali o jeho struktuře
a chemických vlastnostech.

Průběžný výsledek – sacharid v neznámém vzorku:

PRAKTICKÁ ČÁST B. Rozdělovací chromatografie sacharidů

Materiál a vybavení:

2% roztoky sacharidů v 30% isopropanolu (standardní vzorky): ribosa (rib), 2´-deoxyribosa (drib),
glukosa (glc), galaktosa (gal), mannosa (man), fruktosa (fru), maltosa (mal), laktosa (lac),
cellobiosa (cel)

neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu z úlohy 1A (?)

směs ethylacetát:isopropanol:voda (3:2:1)

hydrogenftalátanilinové činidlo (roztok hydrogenftalátu anilinu v butanolu)

Silufol, pravítko, tužka, chromatografická komůrka, kapiláry nebo dávkovače, infralampa,
rozprašovač

Postup:

Na desce Silufolu označte tužkou startovací linii asi 1 cm od okraje. Vzorky (standardy a neznámý
vzorek) nanášejte čistými kapilárami na start tak, aby maximální velikost skvrny byla 2–3 mm
(v pořadí podle tabulky níže). Zkratkou označte druh nanášeného sacharidu. Silufol krátce vysušte
pod infralampou a umístěte do chromatografické komůrky s vyvíjecí směsí (mobilní fáze). Jakmile
čelo mobilní fáze dosáhne vzdálenosti asi 1 cm od horního okraje, označte je tužkou a chromatogram
vysušte 5 minut pod infralampou. Suchý chromatogram postříkejte hydrogenftalátanilinovým činidlem a
umístěte na 30 minut pod infralampu k vysušení. Dále pokračujte až poté, co jste předložili
vedoucímu cvičení výsledek úlohy 1A ke kontrole. Tužkou si označte středy skvrn na chromatogramu.

Výsledky a vyhodnocení:

Vlastní chromatogram odevzdáte připevněný k protokolu.

Uveďte vzdálenost start – čelo rozpouštědla: cm

Určete R[f] vzorků obsahujících známé sacharidy a R[f] neznámého vzorku (viz tabulka).

sacharid

vzdálenost středu skvrny od startu [cm]

R[f]

ribosa (rib)

2´-deoxyribosa (drib)

glukosa (glc)

galaktosa (gal)

mannosa (man)

fruktosa (fru)

maltosa (mal)

laktosa (lac)

cellobiosa (cel)

Přiřaďte k sobě hodnotu R[f] neznámého vzorku a nejbližší hodnotu R[f] mezi známými sacharidy. O
jaký sacharid se jedná? Zakroužkujte jej v tabulce. V případě blízkých hodnot R[f] můžete použít
zbarvení skvrn jako pomocný parametr. Srovnejte výsledek s výsledkem úlohy 1A a definitivně
rozhodněte, který sacharid je obsažen v neznámém vzorku.

Souhrnný výsledek úloh 1A a 1B – sacharid v neznámém vzorku:

PRAKTICKÁ ČÁST C. Stanovení koncentrace redukujících sacharidů Somogyiho metodou

Materiál a vybavení:

standardní roztok glukosy (0,2 mmol.l^-1)

neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu (obsahuje glukosu o neznámé koncentraci)

Somogyi-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, vínanu sodno-draselného a síranu sodného)

Somogyi-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného)

Somogyi-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a hydrogenarseničnanu sodného v kyselině
sírové)

zkumavky, pipety, dávkovače, odměrné baňky 50 ml a 100 ml, kahan a trojnožka nebo vařič, hrnec,
kruhový stojan na zkumavky, vortex, fotometr, kyvety

Postup:

Nejprve si zřeďte část neznámého vzorku pro kvantitativní analýzu následujícím způsobem: pipetujte
1 ml vzorku do 50 ml odměrné baňky a doplňte destilovanou vodou po rysku. Po důkladném promíchání
pipetujte z takto zředěného roztoku 10 ml do 100 ml odměrné baňky, doplňte opět destilovanou vodou
po rysku a důkladně promíchejte (tuto odměrnou baňku označte písmenem N).

Nachystejte si sadu osmi zkumavek, které důkladně vypláchnete destilovanou vodou!

Používejte pouze dokonale čisté zkumavky a pipety. Metoda stanovení je velmi citlivá, jakákoliv
stopa redukujících látek hrubě zkresluje její výsledek.

Podle tabulky připravte nejprve sadu šesti roztoků o celkovém objemu 0,5 ml a známé koncentraci
glukosy k sestrojení kalibrační přímky (zkumavky č. 1–6). Pipetujte podle rozpisu pipetami, které
jste vypláchli destilovanou vodou. Zkumavka č. 1 neobsahuje glukosu vůbec, proto se použije jako
slepý vzorek. Do zkumavek č. 7 a 8 pipetujte zředěný neznámý vzorek z odměrné baňky označené
písmenem N.

zkumavka č.

pipetovaný objem

vypočtená

c(glc)

[mmol.l^-1]

A[740]

0,2 mmol.l^-1 roztok glc [ml]

zředěný neznámý vzorek

(odměrná baňka N) [ml]

destilovaná

voda

[ml]

0,0

0,5

0,00

0,1

0,0

0,4

0,2

0,0

0,3

0,0

0,2

0,4

0,0

0,1

0,5

0,0

Ø A[740]

0,0

0,5

0,0

0,5

0,0

V úloze pracujete s toxickými činidly (zejména Somogyi-Nelsonovo činidlo III) – pracujte se
zvýšenou opatrností!

Do všech zkumavek dávkujte (pumpičkovým dávkovačem) 0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla I, vzorky
důkladně promíchejte a zahřívejte asi 5 minut ve vroucí vodní lázni. Potom přidejte (pumpičkovým
dávkovačem) do všech vzorků 0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla II a zahřívejte ve vroucí vodní lázni
dalších 10 minut.

Po ochlazení na laboratorní teplotu (lze chladit pomocí studené vody) přidejte pumpičkovým
dávkovačem do všech vzorků 2 ml Somogyi-Nelsonova činidla III, vzorky promíchejte a po 5 minutách
stání při laboratorní teplotě (zbarvení je stálé po dobu několika hodin) opět promíchejte (vypuzení
oxidu uhličitého ze vzorku).

Změřte absorbanci roztoků č. 2–8 při vlnové délce 740 nm proti slepému vzorku č. 1 (roztoky po
měření vracejte do zkumavek), výsledky zapište do tabulky. V případě výskytu bublinek (CO[2])
v kyvetách zaťukejte kyvetou jemně o stůl, čímž CO[2] vypudíte. Přesáhne-li absorbance některého z
roztoků hodnotu 0,8 (nad touto hodnotou již není závislost absorbance na koncentraci lineární –
neplatí Lambert-Beerův zákon), zřeďte celou sadu roztoků č. 1–8 v poměru 1:1 destilovanou vodou;
naměřenou hodnotu absorbance musíte v tomto případě vynásobit dvěma.

Vzhledem k tomu, že kalibrační graf pro stanovení redukujících sacharidů budete používat v dalších
úlohách (úloha č. 6), je nezbytně nutné získat správné výsledky. Nesprávnou závislost ihned
konzultujte s vyučujícím.

Vyhodnocení:

Vypočítejte koncentrace glukosy ve zkumavkách č. 2–6, výsledky doplňte do tabulky. Vypočítejte
průměr absorbancí ve zkumavkách č. 7–8 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost
A[740] na koncentraci glukosy). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak
vypočítejte koncentraci glukosy ve zředěném neznámém vzorku (výpočet uveďte níže):

Vypočítejte, kolikrát byl zředěn původní neznámý vzorek při přípravě neznámého zředěného vzorku
(odměrná baňka N).

Ředění neznámého vzorku: krát

Tímto faktorem vynásobte koncentraci glukosy ve zředěném neznámém vzorku, abyste získali
koncentraci glukosy v původním neznámém vzorku.

Výsledek:

koncentrace glukosy v neznámém vzorku stanovena Somogyiho metodou: c = mmol.l^-1

KONTROLNÍ LIST

jména:

obor:

datum provedení:

neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu

A B C D E F G H (zakroužkujte)

neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu

a b c d e f g h (zakroužkujte)

ÚLOHA 2A

Průběžný výsledek – možné sacharidy v neznámém vzorku:

Podpis vedoucího cvičení:

ÚLOHA 2B

Souhrnný výsledek úloh 1A a 1B – sacharid v neznámém vzorku:

Podpis vedoucího cvičení:

ÚLOHA 2C

zkumavka

č.

A[740]

0,000

Podpis vedoucího cvičení: