9
LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ
PATOLOGIE
Příprava metagenomické knihovny
Amplifikace
□ 1 Izolace DNA dle typu vzorku
□ 2 Kvantifikace DNA (optional)
□ 3 Sestavení PCR reakce
Master mix	lx	X
Polymeráza 2x	10,0 Lil	
FW primer 2,5 líM	2,0 Lil	-
REV primer 2,5 líM	2,0 Lil	-
DEPC-H2O	9,0 Lil	
Vzorek DNA	2,0 Lil	
□ 4 Amplifikace dle programu (nastav ramp rate annealingu 60%)		
Program cykleru	Teplota	Čas
Iniciální denaturace	95 °C	3 min
Denaturace 95 °C        45 s
Annealing 52 "C        60s 35x
Extenze 72 °C        90 s
Finálni extenze_72 "C_5 min
12 °C Hold
Purifikace
□ 1 Připrav si čerstvý 80% EtOH (0,5 ml na každý vzorek)
□ 2 AMPure beads musí mít RT
□ 3 Vortexuj AMPure beads 60 vteřin
□ 4 Přepipetuj si 25 u.1 PCR reakce do l,5ml eppendorfky
□ 5 Přidej 20 u.1 AMPure beads a směs propipetuj nebo zvortexuj
□ 6 Inkubuj 5 min při RT
□ 7 Dej na magnet na 2 minuty při RT
□ 8 Nech na magnetu a odstraň supernatant
□ 9 Přidej 200 u.1 80% EtOH na 30 vteřin a poté EtOH odstraň
□ 10 Přidej znovu 200 u.1 80% EtOH na 30 vteřin a znovu EtOH odstraň
□ 11 Odstraň zbytky EtOH a nech zbytek odpařit. Pelety nesmí vyschnout.
□ 12 Sundej zkumavku z magnetu
□ 13 Přidej eluční pufr podle očekávané koncentrace (15-30 u.1).
□ 14 Propipetuj nebo vortexuj.
□ 15 Inkubuj 5 min při RT
□ 16 Dej znovu na magnet na 2 min při RT
□ 17 Odeber supernatant s přečištěnou DNA
Kvantifikace, kvalita & pooling
□ 1 Změř koncentraci pomocí HS dsDNA reagentu pro Qubit na LightCycIeru
Master mix	4x	X
Dye	1,0 Lil	
Pufr	199,0 Lil	-
□ 2 Nařeď vzorek na domluvenou koncentraci
(Nejnižší rozumná koncentrace podle vzorků)
□ 3 Smíchej naředěné vzorky dohromady po skupinách po 6-8 vzorcích (pooling)
□ 4 Smíchej pooly vzorků do finální knihovny
□ 5 Připrav běh na FragmentAnalyzeru podle návodu na počítači
(analyzuj všechny pooly a finální knihovnu)
□ 6 Nařeď pooly a knihovnu 1000x a 10000x
□ 7 Připrav qPCR reakci
Master mix	lx
NEBNext Quant MM	16,0 Lil
Vzorek / standard	4,0 Lil
□ 8 Vypočítej molární koncentraci knihovny
□ 9 Připrav sekvenační běh dle návodu
9
LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ
PATOLOGIE
Layout pro identifikaci vzorků
Každý vzorek musí mít unikátní kombinaci indexů P7 a P5!
Indexační primery jsou 10 U.M - pro PCR je potřeba primery 4x naředit na 2,5 U.M koncentraci. Zapiš si kombinace indexů svých vzorků pro pozdější vyhodnocení.
N701   N702   N703   N704   N705   N706   N707   N708   N709   N710   N711 N712
S518
5502
5503
5504
5505
5506
5507
5508