1
Podstata nádorové
transformace buněk aKontrola buněčného cyklu.
Nádorová transformace buňky.
Interakce nádoru a organismu.
Metastazování.
2
Nádory (tumory)
 Nádor je patologický stav (nemoc) v důsledku porušené kontroly buněčného
dělení
– příčinou porušené regulace je genetická změna nejčastěji 1 somatické (ale i
germinativní) buňky
– buňky vycházející z patologického klonu se nekontrolovaně množí (různě rychle) a
posléze event. šíří i na další sekundární místa (metastázy)
 podle rychlosti proliferace rozlišujeme nádory
 benigní – většinou rostou jen v místě vzniku, nejsou agresivní, zachovávají si diferenciaci
 maligní – rostou rychle, invazivně a šíří se na další místa, nediferencované
 Všechny nádory jsou důsledkem genetické poruchy, a to klíčových genů kontroly
buněčného cyklu
 (proto)onkogenů – normálně podporují dělení a růst buněk, pokud mutovány dělení je
nekontrolované
 supresorových genů – normálně kontrolovaně potlačují dělení, pokud mutovány, umožňují
nekontrolované dělení
 DNA reparačních genů – normálně opravují DNA opravitelné změny, pokud mutovány
neopravená změna může být přenesena do dceřinných bb.
– pouze některé jsou ovšem zároveň dědičné (tzv. familiární) = mutace v germinativní
buňce
– většina nádorů jsou náhodné, tzv. sporadické = mutace v somatické buňce
3
Nádory
 Genetická změna může vzniknout
– chybou při DNA replikaci a dělení buňky
– působením zevních faktorů (karcinogenů)
 fyzikálních – např. UV a ionizující záření
 chemických – organické látky, toxiny, těžké
kovy
 biologických – některé RNA a DNA viry
 Nádor zpravidla původně vychází z mutací 1
buňky (monoklonální)
– proces nádorové transformace je ovšem
vícestupňový (tj. postupná kumulace několika
mutací), takže se postupně stává geneticky
heterogenní
 nádor přechází ze stadia prekancerózy, přes
benigní až k malignímu
 Histologicky – tj. podle toho z jaké tkáně
pochází – rozlišujeme 3 sk.
– epiteliální
 kůže, sliznice, výstelky vývodů
 papilom, adenom (b.), karcinom (m.)
– mesenchnymální
 pojivo, endotel, sval. tkáň, hematopoetická a
lymfatická tkáň, kosti
 fibrom, hemangiom, myom (b.), sarkom,
lymfom, leukemie (m.), …….
– neuroektodermové
 CNS a periferní nervy, pigmentové névy
 astrocytom, gliom, blastom, neurinom, melanom
4
Které geny jsou změněny během
kancerogeneze?
 Nádor není monogenní onemocnění.
 Odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-7
událostí (zásahů).
 Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze
změněny, jsou desítky.
 Obecně existuje šest základních vlastností plně maligního
nádoru:
5
Šest získaných vlastností maligního
nádoru
1. Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras
2. Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB
3. Poškození apoptózy produkce IGF
4. Neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy
5. Posílení angiogeneze produkce VEGF
6. Tvorba metastáz inaktivace E-cadherinu
Získaná schopnost Příklad
6
Normální vs. rakovinná buňka
7
Vývoj rakoviny je postupný proces
kumulace změn
8
Buněčný cyklus
 buněčný cyklus (4 fáze)
– cyklická souhra reakcí zajišťujících
růst buňky (G1-fáze), DNA replikaci
(S-fáze), G2 a mitózu (M-fáze)
 b. cyklus probíhá při
– bezchybném provedení jednotlivých
kroků
 správnost reakcí je kontrolována ve 3
kontrolních bodech
 v G1-fázi - po skončení
předcházející M-fáze
 v G2-fázi – po skončení replikace
 v M-fázi - metafáze
– dostatku energetických substrátů
– dostatku zevních (mitogenních)
stimulů
 růstové faktory
 přirozeně je inhibován (bb. v G0-
fázi)
– kontaktní inhibicí
– produkty supresorových genů
 inhibitory cdc (např. p21)
– nedostatkem růstových faktorů
 porucha regulace  nádorové
bujení
9
Jednotlivé fáze buněčného cyklu
G0-fáze klidová fáze buněčného cyklu, ve které buňka p ln í své z ákladní funkce
a udrž uje baz ální m etabo liz m us
G1-fáze interval mezi ukončením mitózy a začátkem syntézy DNA - intenz ivní
syntéz a všech typů RNA v jádře, v cyto plazm ě pro bíhá pro teo syntéz a
a buňka ro ste ( délka G1- fáz e o bvykle určuje délku celého b. cyklu)
S-fáze v jádře probíhá replikace DNA a v cyto plaz m ě jso u syntetizovány
histo ny; po uko nčení S- fáz e buněčné jádro o bsahuje dvo jnáso bné
m nož ství DNA
G2-fáze interval mezi koncem syntézy DNA a začátkem mitózy, je typický
dalším růstem buňky, pro teo syntézo u, přičem ž ve zvýšené m íře je
syntetizován tubulin a další pro teiny slo už ící k výstavbě m ito tického
aparátu; v G2 - fáz i cyklu pro bíhá ko ntro la uko nčení DNA rep likace
před vstupem do m itóz y
M-fáze proces mitotického dělení sestává z řady na sebe navaz ujících z m ěn
( 6 fáz í) , z nichž prvních pět ( pro fáz e, prom etafáz e, m etafáz e,
anafáze, telo fáz e) představuje dělení jádra ; šesto u fáz í je vlastn í
roz dělení bu ňky ( cyto kinez e)
10
Kontrolní body b. cyklu / mitóza
11
Regulační proteiny b. cyklu
 (A) produkty (proto)onkogenů
– cykliny
– cyklin-dependentní proteinkinázy (cdk)
– růstové faktory
– receptory růstových faktorů
– G-proteiny
– membránové tyrozinkinázy (např. abl)
– cytoplasmatické signální proteiny (např. Raf)
– transkripční faktory (např. jun, fos, myc)
 (B) produkty supresorových genů
– Rb
– p53
– p21
 (C) produkty genů kódujících DNA reparační enzymy
– mismatch reparace
– excisní reparace
– homologní rekombinace
12
Protoonkogeny
 (1) cykliny
– 8 typů – A, B, C, D, E, F, G, H
– specifické pto jednotlivé fáze cyklu
 např. Cdk2 + cyklin E v G1 fázi
 (2) cdk (cyclin-dependent kinases)
– 9 typů – cdk1 – cdk9
 pouze komplex cdk s cyklinem je aktivní
 fosforylují seriny a threoniny cílových proteinů
a aktivují je
např. Rb-protein  iniciace DNA replikace
 součástí komplexů cyklin/cdc jsou inhibitory
cdc (např. p21), teprve jejich proteolýza
umožňuje aktivitu komplexu
– zatímco hladina cdk zůstává během cyklu v
podstatě konstantní, exprese cyklinů se liší
 je striktně kontrolována podle potřeb okolní
tkáně!!!
13
Souhra cyklinů – cdk
14
Protoonkogeny
 (3) růstové faktory
– působí ve velmi malých koncentracích,
většinou parakrinně, tkáňově specificky
 např. TGF-β, PDGF, EGF, VEGF, …
 (4) receptory růstových faktorů
– tyrosinkinzázová aktivita  aktivace
dalších kináz (MAPK – Mitogen
Activated Protein Kinase) a transkripce
genů
 geny “časné” odpovědi (cca 15 min) =
(5) transkripční faktory
např. proteiny fos, jun a myc (produkty
protoonkogenů fos, jun a myc)
 geny “pozdní” odpovědi (cca 1 hod) cykliny
(cyklin D)
jejich exprese stimulována pomocí
“časných” proteinů fos, jun, myc aj.
15
Protoonkogeny
 (6) cytoplasmatické Tyr- (Src, Abl, …) a Ser/Thr-kinázy
(Raf) a GTP-ázy (Ras)
16
Ras signalizace
17
Supresorové geny
 kódují inhibiční proteiny zastavující b. cyklus
– (1) Rb protein (ch. 13q14)
 hl. negativní regulátor b. cyklu, řídí přechod z G1- do S-fáze, aktivita řízena de/fosforylací
(pomocí cdk4/6 + cyklin D)
 mutace Rb (nejč. mikrodelece) vedou ke vzniku retinoblastomu (nádor sítnice)
– (2) p53 protein (ch. 17p13)
 “strážce genomu” – kontrola cyklu v G1 a G2 kontrolních bodech
 při poškození DNA se zvyšuje exprese p53
 funguje jako transkripční faktor genů reparace DNA a apoptózy
– (3) p21
 hl. cílový gen p53 = inhibitor Cdk – zastavení cyklu v G1 fázi inhibicí Cdk2/cyklin
E komplexu
– (4) BRCA1 a BRCA2
 součást detekčního systému DNA poškození
 mutace v supresorových genech jsou podkladem dědičných typů rakovin
– často názvy podle typu nádoru, který vzniká při jejich mutací, např.
 Rb (retinoblastom)
 WT (Wilmsův tumor)
 NF1 a NF2 (neurofibromatóza)
 APC (adenomatózní polypóza coli)
 VHL (von Hippel-Lindau syndrom)
18
Rb protein (Rb/E2F G1 checkpoint)
19
Rb protein - retinoblastom
 mikrodelece v oblasti
chr. 13q14 vedou k
poruše Rb
– vrozené – familiární
retinoblastom
 pacient zdědil jednu
mutovanou alelu, druhá
mutace brzy v průběhu
života
ztráta vrozené
heterozygosity (LOH)
– získané – sporadický
retinoblastom
 inaktivace Rb mutacemi
obou alel v průběhu
života
20
Vznik sporadického retinoblastomu
mechanizmem LOH
21
Shrnutí – nastartování b. cyklu
 mitogeny startují b. cyklus indukcí cyklinu D a inaktivací Rb proteinu
– průběh cyklu je koordinován postupnou aktivací jednotl. CDKs a jejich podjednotek –
cyklinů (oscilujících mezi rychlou syntézou a degradací)
– exprese cyklinu D (a do jisté míry cyklinu E) indukovaná mitogeny představuje začátek
cyklu
 cyclin D- a cyclin E-dependentní kinázy fosforylují a tak blokují Rb protein, hl. kontrolní bod
přechodu G1 do S fáze
– inaktivace Rb proteinu představuje moment, kdy b. cyklus přestává být závislý na
mitogenech
 inaktivací Rb se uvolní E2F transkripční faktory, které stimulují expresi dalších cyklinů a
ostatních genů nutných pro DNA syntézu
22
Protein p53 (ch. 17p13)
 při poškození DNA se
aktivuje p53
– stabilizací ( ubiquitin
ligázy MDM2)
– fosforylací prostřednictvím
ATM (ataxia telangiectasia
mutated)
 p53 dále zprostředkuje:
– (1) expresi inhibitorů b.
cyklu (p21)  dočasné
zastavení b. cyklu v G1/S
kontrolním bodě, které
umožní reparaci DNA
– (2) zvyšuje expresi GADD
45 (Growth Arrest and DNA
Damage)  excizní
reparace DNA
– (3) pokud není oprava
úspěšná, zvyšuje expresi
Bax  apoptóza
 mutace p53 jsou přítomny
cca u 50% všech nádorů!!!
23
DNA reparační geny
 (1) geny reparace chybného párování
(“mismatch repair”)
–  nestabilita délky mikrosatelitových
lokusů (např. HNPCC = Hereditary NonPolypous
Colon Cancer)
 (2) geny excizní reparace
 (3) geny homologní rekombinace
– hlavní dráha aktivovaná při poškození
DNA (double strand break) zahrnuje:
ATM (ATR)/CHK2 (CHK1)  p53/MDM2
 p21  “growth arrest”
 vrozená porucha reparačních genů je
podkladem několika dědičných typů
nádorových onemocnění
 ataxia telengiectatica
 Bloomův syndrom
 Fanconiho anemie
 xeroderma pigmentosum
 Syndrom fragilního X
24
Proces nádorové transformace
 jakákoliv mutace v kritickém místě DNA
 tj. protoonkogen, supresor, reparační gen
– chromozomové aberace
 translokace, inzerce, delece, duplikace
– genové mutace
 bodové mutace, délkové (ins/del)
 mutageny/karcinogeny
– fyzikální
 UV (karcinom a basalion kůže, melanom)
 ionizující záření a RTG záření (leukemie, št. zláza, kosti, …)
– chemické
 polycyklické aromatické a chlorované uhlovodíky, aromatické aminy,
nitrosaminy, těžké kovy, mykotoxiny
 některé toxické až po metabolické transformaci v organizmu, popř.
při tepelném zpracování (potrava)
 nádory GIT jako důsledek expozice karcinogenům v dietě
 nádory plic jako důsledek kouření
 alkoholická cirhóza
– biologické = inkorporace virového genomu do hostitelského,
opět v kritických místech
 DNA viry
 herpes (EBV - lymfomy)
 hepdnaviry (HBV – hepatocelulární ca)
 papovaviry (papilomaviry – ca děložního čípku, hrtanu, ústní dutiny)
 adnoviry
 RNA viry – retroviry
 HIV - Kaposiho sarkom, B-lymfom
 HTLV – T-buněčná leukemie
– prekancerózy = chronická iritace tkáně zánětem
 Baretův jícen při GER
 ulcer=ozní kolitida a Crohnova nemoc
 divertikulitida
25
Růst tumoru
 dělení v klonu nádorových buněk: N=2n
– 2, 4, 8, 16, 32, …..
 10 dělení = ~1 000 bb.
 20 dělení = ~1 000 000 bb. (m=1mg)
 30 dělení = ~1 000 000 000 bb. (m=1g)
 40 dělení = m=1kg
při 12-ti hodinovém b. cyklu za zhruba 20 dní
 ve skutečnosti je ovšem růst nádoru mnohem
pomalejší - dělení  zánik buněk
– prodlužování trvání b. cyklu
– neproliferující frakce bb. (diferencované)
– zánik bb. (malnutrice, cytotox. lymfocyty)
– mechanické ztráty bb. (odlupování např. ve
střevě)
 podmínkou růstu je vytvoření nádorového
stromatu a kapilární sítě (angiogeneze)
– pak převažuje proliferace nad zánikem buněk
26
Růst tumoru: další faktory ovlivňující b. cyklus
 mezibuněčná komunikace
(~kontaktní inhibice)
– integriny – spojení s ECM
– cadheriny – spojení bb. mezi sebou
27
Růst tumoru: další faktory ovlivňující b. cyklus
 metabolismus = potřeba energie
(kyslík a substráty)
– buněčná masa velikosti okolo 1mm3
(cca 1106 buněk) není bez vaskularizace
schopna dále růst (proliferace je v rovnováze
s apoptózou)
– v odpovědi na hypoxii je regulován hypoxia- inducible factor-
1a (HIF-1a), který po translokaci do jádra ovlivňuje
transkripci řady genů, mimo jiné
 represe E-cadherinu
  exprese GLUT1 a 3 =  substráty
také efekt hormonů a růst. faktorů
 vascular endothelial growth factor (VEGF) a angiopoetin
tento stimuluje novotvorbu cév (angiogeneze) nutných pro další růst nádoru
 chemotaxe makrofágů do tumoru a produkce dalších angiogenních a růstových
faktorů
VEGF
basic fibroblast growth factor (bFGF)
transforming growth factor-b (TGF-b)
platelet-derived growth factor (PDGF)
28
Hypoxií-indukovaná transkripce genů
29
Angiogeneze
30
Inflitrace tumoru makrofágy
31
Imunitní systém vs. nádor
 nádorové bb. mají některé imunologické odlišnosti
– změny přirozených povrchových antigenů (např. ztráta MHC)
 unikají imunitnímu rozeznání a likvidaci
– exprese nových (tzv. onkofetálních) antigenů
 diagnostické markery (např. CEA, -fetoprotein aj.)
 v protinádorové imunitě se uplatňují cytotoxické mechanizmy
– CD8+ T-lymfocyty
– NK bb.
32
Hormonální stimulace
 růst některých tumorů
je výrazně potencován
hormony (nejč.
pohlavními)
 ca prsu, dělohy,
vaječníků, prostaty
33
Invazivita tumoru
 nádorové bb. získavají ztrátou
adhezivních proteinů (E-cadherinu)
“motility” fenotyp (epithelialmesenchymal
transition, EMT)
– ztráta apikobazální polarizace bb.
 epitelové nádory (karcinomy) tvoří
2/3 všech nádorů
– produkce proteolytických enzymů
nádor. bb.
 matrix metalloproteinázy (MMP)
degradují extracelulární matrix a
umožňuje “pučení”nových cév a
extravasaci nádor. bb.
– rezistence k anoikis
 forma apoptózy iniciovaná
“odloupnutím” epitel. b. od ECM
34
Metastazování
 vytváření dceřinných nádorů vzdálených od primárního ložiska
– krví
 často po směru toku
 např. z GIT do jater
 např. venózní krví do plic
 např. z plic tepennou krví do kostí a mozku
– lymfou
 nejprve nejbližší lymf. uzliny, poté vzdálenější
35
Příklad – kolorektální karcinom
36
Interakce nádoru a hostitele
 místní působení nádoru
– mechanický útlak (např. nádory
mozku)
– obstrukci (např. nádory žl. cest)
– krvácení, snadná tvorba modřin
(leukemie)
– krvácení do GIT (nádory střeva a
žaludku)
– edém (např. lymfomy)
– trombózy (DIC)
– porucha zraku (útlak zrak. nervu
adenomem hypofýzy)
– porucha hlasu (ca hrtanu)
– kašel (ca plic)
– porucha polykání (ca jícnu)
– zlomenina kosti (myelom)
 celkové působení
– zvýšení teploty
 produkce cytokinů (pyrogenů)
nádorem (např. IL1, TNF)
– nádorová anorexie/kachexie
 kombinovaný důsledek
– paraneoplastické syndromy
 některé tumory produkují
hormony (adenomy)- důležitý
diagnostický znak!
pigmentace, endokrinopatie
(např. Cushing),
hyperkalcemie, atd.
37
Klasifikace nádorů
 morfologická diagnostika = typing
– určení histologického typu
 hodnocení invazivity = grading
– stupeň benignity  malignity
 určení iniciálního rozsahu = staging
– TNM klasifikace (T = tumor, N = node (uzliny), M = metastasis)
38
Některé následky nádorů
 Hyperkalemie
 Hypoglykemie
 Anémie
 Acidóza
 Hormonální poruchy
 Nádorová kachexie
39
Nádorové markery
 Zhoubné novotvary patří k nejčastějším
příčinám úmrtí
 Růst incidence jakých typů tumorů?
 Dochází k posunu do mladších věkových
kategorií
 Cílem je co nejčasnější diagnostika
 Zobrazovací metody vs. imunochemické
metody
 Metodické zdokonalování
40
Co to jsou nádorové markery ?
 Molekuly proteinového charakteru
– Celulární tumorové markery
– Humorální nádorové markery
 Produkce nádorových markerů
– Přímo nádorové buňky (s nádorem asociované antigeny)
– Jiné tkáně jako odpověď na maligní proces
(indukované nádorové markery)
41
Vlastnosti „ideálního“ nádorového
markeru
 Vysoká specifičnost vzhledem k
malignímu onemocnění
– Pacienti bez zhoubného nádoru by měli
poskytovat negativní výsledek testu
– Zdaleka to neplatí
– Falešně pozitivní výsledky u řady
nenádorových onemocnění (záněty)
42
• Vysoká orgánová specifičnost
– Pozitivní hodnota by měla cíleně vypovídat
o postižení konkrétního orgánu
Tumorový marker Onemocnění či jiná příčina
CEA Záněty jater, cirhóza, pankreatitida, kouření
AFP Jaterní cirhóza, hepatitida
CA 15-3 Jaterní cirhóza, hepatitida, snížení GFR
PSA
Benigní hyperplazie prostaty, vyšetření per
rectum, katetrizace močového měchýře
hCG Mola hydatidosa, těhotenství
Vlastnosti „ideálního“ nádorového
markeru
43
• Vysoká citlivost
– Schopnost laboratorního ukazatele
prokázat přítomnost zhoubného nádoru v
počátečním stádiu
– Mnoho tum. markerů tuto podmínku
nesplňuje – zvýšení až u velkých
generalizovaných tumorů
– Citlivost můžeme zvýšit kombinací
několika tumorových markerů
Vlastnosti „ideálního“ nádorového
markeru
44
• Korelace mezi výší lab parametru a
velikostí nádoru
– Koncentrace závisí nejen na rozsahu
nádoru (staging), ale i na stupni zralosti
(grading) jeho buněk, ale také na
schopnosti produkovat určitý marker a
vyplavovat ho do krve
Vlastnosti „ideálního“ nádorového
markeru
45
Oblasti užití tumorových
markerů
• Screening zhoubných nádorů
• Diagnostika zhoubného novotvaru
• Určení stádia nádoru a jeho prognózy
• Sledování průběhu choroby a efektu
terapie (remise vs. relaps)
46
Konkrétní příklady nádorových
markerů
 Onkofetální a onkoplacentární antigeny
– Alfa1 fetoprotein (AFP)
 Produkují buňky žloutkového vaku a jater plodu
 U dospělých je koncentrace minimální
 Koncentrace se zvyšuje u primárního karcinomu jater
– CA 15-3
 Používá se pro stanovení posouzení úspěšnosti léčby a
včasné předpovědi recidivy u karcinomu prsu
– hCG
 Diagnostika gravidity
 Vysoké hodnoty při mola hydatidosa – přechod v
choriokarcinom
 U mužů v případě germinativních nádorů
47
• Enzymy
– PSA
• Produkován buňkami prostaty
• Není úplně zřejmá fce
– PACP (prostatická kyselá fosfatáza)
• Podobné indikace k vyšetření jako u PSA
– ALP
• Je zvýšený u osteosarkomu
– LDH
– Katepsin D
• Intracelulární proteáza
• Degraduje bazální membránu – umožňuje invazívní růst a
metastázování nádoru
• Ca prsu
• Nové nádorové markery
48
Tkáňová analýza
49
Zdroje „blood based“
biomarkerů
50
„Multiomic approaches“
51
Nové biomarkery karcinomu
prostaty
• PSA
• MT (protein)
• AMACR
• Caveolin
• Sarkosin
• MMP
• microRNA (miR 23a, miR 320)
• MT (mRNA)