Purifikace rekombinantních proteinů Purifikace proteinu z komplexní směsi makromolekul přítomných v biologickém vzorku 3 10 Acidic pH Basic Analýza buněčného extraktu 2D elektroforézou • Několik tisíc proteinů z různými vlastnostmi (-5000-8000) a v různých množstvích (aktin ~ 10%, unikátní trankripční faktor < 0,001% z celkového množství proteinů) • DNA, RNA, polysacharidy, lipidy Dezintegrace biomasy Fyzikální metody: sonikace ultrazvukem, tlakem v přístroji French press, osmotický šok, střižné síly v různých typech mlýnků a homogenizátorů - při sonikaci či mechanických metodách nutno chladit! Chemické: detergenty, chelátory v lyzačních pufrech, organická rozpouštědla - látky mohou interferovat s následnou purifikační metodou Enzymatické: nutno volit podle expresního systému Lysozym pro bakterie, lytikázu nebo zymolázu (glukanázy) pro kvasinky. Při všech lyzačních postupech dochází k destrukci buněk a uvolnění jejich obsahu včetně proteolytických enzymů. Proto je vhodné do lyzačního pufru přidávat inhibitory proteáz, které v průběhu dezintegrace i dalších kroků zabrání degradaci produktu. Než začneme........................... 1. Proč??? Pro jaký účel ? 2. Jak??? Jak protein detekovat? 3. Co??? Jaké vlastnosti má protein ? 1. Proč? ?? Pro j aký účel ? ___,_n_,_v___,_ Aplikace Množství Čistota Poznámka Identifikace 0,002-0,2 |ig vysoká (>J95%) • Edmanovo odbourávání (5-10 pmol), přístupy hmotnostní spektroskopie (0,2-1 pmol) Produkce protilátek |ag-mg střední-vysoká • Pro imunizaci: -0,1 jug proteinu • Čím větší čistota tím větší a rychlejší šance pro zisk vysoce specifické imunitní odpovědi. Enzymologie 1-5 mg vysoká > 95 % • Množství proteinu závisí na citlivosti analýzy. • Čistota závisí na specificitě analýzy a ovlivnění výsledků analýzy kontaminacemi. Biofyzikálni studie mg-g vysoká (>95%) • CD spektroskopie, rezonance povrchových plasmonů, fluorimetrie, analytická ultracentrifugace, UV spektroskopie 3D struktura (krystalizace, NMR) 10-20 mg vysoká (>J95%) • Hledání kryštalizační ch podmínek ~ 1-2 mg proteinu, zisk krystalu o velikosti dostatečné pro rentgenovou difřakci 5-10 mg proteinu • Pro první 1-D NMR spektra se vyžaduje ~ 0,5 jimol proteinu, protein (velikost 5-20kDa) značený 15 N / 13C je nutný pro vyřešení struktury. Farmaceutické účely mg-kg vysoká (99,9%) • Pro klinické účely nesmí proteiny obsahovat pyrogeny a bakteriální toxiny a musí být velmi stabilní kvůli dlouhodobému skladování. 2. Jak??? Jak protein analyzovat? 1. Poly akry lam idová gelová elektroforéza za denaturujících(SDS PAGE) nedenaturujících podmínek (NATIVE PAGE) se specifickou detekcí: _ Detekce proteinu zájmu během jeho purifikace SDS PAGE s následných • Pomocí protilátek westernovým přenosem Sledování biologické aktivity proteinu během purifikace • U enzymů např. barvení v gelu pomocí chromogenních substrátů (nebo stanovení specifických konstant v komplexních vzorcích) nativní PAGE, zymogram 2. Jak??? Jak protein analyzovat? 2. Poly akry lam idová gelová elektroforéza za denaturu jících podmínek s nespecifickou detekcí • Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,... • Sledování čistoty purifíkovaného proteinu 28% čistota 80% čistota 95% čistota 2. Jak??? Jak protein analyzovat? 3. Polyakrylamidová gelová elektroforéza za nativních podmínek s nespecifickou detekcí • Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,... • Sledování homogenity purifíkovaného proteinu Nativní PAGE — Dimer — —- — — Monomer 4. Stanovení koncentrace proteinu • Nejvíce využívané metody: dle Bradfordové, Lowryho metoda,. 3. Co??? Jaké vlastnosti má protein ? Informace o proteinu zájmu a příbuzných proteinech z databází nebo z pilotních experimentů: • Velikost proteinu (SDS PAGE, gelová filtrace nebo analytická centrifugace) • Izoelektrický bod (izoelektrická fokusace) • Stabilita (pH, teplota, přítomnost solí, proteas, additiv zajišťujících rozpustnost proteinu) 2D a nativní PAGE • Komplexita vzorku, vlastnosti proteinu zájmu a i ostatních kontaminujících proteinů Informace o proteinu zájmu a o příbuzných proteinech z literatury: • Strategie purifikace (metody, pufry, stabilita proteinu,.....) Vlastnosti/purifikační metody Negative charges Hydrophobic groups Affinity binding sites ^^■^J Positive charges Molecular weight (size) Rozpustnost Stabilita Velikost/tvar pi (povrchový náboj) Hydrofobicita precipitace např. síranem amonným, nízké/vysoké pH teplotní precipitace gelová filtrace (gelová permeační chromatografie) iontově výměnná chromatografie hydrofóbní chromatografie Specifická vazba afinitní chromatografie Afinitní chromatografie - specifická vazby mezi molekulami - nejčastěji se jedná o specifickou interakci afmitních fúzních tagů (např. polyhistidin, glutathion-S-transferáza, atd.) s Ugandy (např. kov, glutathion, atd.) v chromatografických matricích Iontově výměnná chromatografíe - separace na základě celkového náboje Gradient se zvyšující se koncentraci soli (NaCl) Cl- kompetuje s proteinem o vazbu na matrici Stacionární fáze: média s kationtovými a aniontovými skupinami Mobilní fáze: opačný iont přidaný do pufrů. Iontově výměnná chromatografie binds den*tur*rh.in Pi rJn-na!uTa:iar hindi Reslr Type Cation Exchanger 10 Net charge ol motecUe of interest + — pil Charge Of resin — + Running conditions 0.5-1.5 pH units below the pi of the molecule of interest 0.5-1.5 pH units above the pi of tne molecule of interest Funkční skupiny používané na iontor Anex (anion exchanger) Quaternary ammonium (Q) strong Diethylaminoethyl (DEAE)* weak Diethylaminopropyl (ANX)* weak Katexy (cation exchanger) Sulfopropyl (SP) strong Methyl sulfonate (S) strong Carboxymethyl (CM) weak ěničových matricích -CH2-N+-(CH3)3 -CH2-CH2-N+-(CH2-CH3)2 -CH2-CHOH-CH2-N+-(CH2-CH3)2 -CH2-CH2-CH2-S03- -CH2-S03- - CH2-COO- Hydrofóbní chromatografie v.v. y w r -j »*\\ - vzorek aplikován ve vysoké koncentraci soli - sůl snižuje solvatační obal exponují se hydrofobní oblasti Používané Ugandy Phenyl -0- Butyl-S -S-iCH^-CH, Butyl -O-ÍCH^-CH, Octyl -P-ÍCH^CHj Ether -O-CH^HOH-CH^-OH Isopropyl -Q^CH-{tHjř Gelová permeační chromatografie (gelová filtrace) matrice složená z kulatých porézních částic, na které se molekuly proteinu neváží. • Size-exclusion chromatography separates proteins on the basis of size. • Molecules move through a bed of porous beads. Smaller molecules diffuse further into the pores of the beads and therefore move through the beads more slowly, while larger molecules enter less or not at all and thus move through the beads more quickly. • Both molecular weight and three-dimensional shape contribute to the degree of retention. Kolik purifikačních kroků je potřeba? Cd, dočistení Dosaženi vysoké čistoty cílového proteinu-odstranění drobných nečistot, proteinů podobných vlastností (JSalší purifikace;^^ Odstranění většinv zisk cílového protein EINÍ) ly nečistot - jiné proteiny, nukleové kyseliny......, další zakoncentrování cílového proteinu Obohacení vzorku cílovým proteinem, zakoncentrování a stabilizace cílového proteinu príprava vzorku pro chromatografii Odstranění nesolubilních podílu hrubého extraktu, lipidů -► purifikační kroky Logická kombinace purifikačních kroků Každá separační technika je vyznačuje rovnováhou mezi čtyřmi parametry. Rychlost krokuje důležitá zejména v kvůli možné degradaci cílového proteinu působením proteas v komplexním vzorku. Rozlišení Rychlost Rozlišení je rozsah separace mezi dvěma chromatografickymi píky (bez dostatečného rozlišení nedochází k separaci proteinů). Kapacita Výtěžek Výtěžek-minimalizace ztráty proteinu během purifikace. Kapacita (max.) je maximální množství vzorku, které může být navázáno na chromatografickou kolonu. Zisk cílového proteinu z proteinového extraktu Cíl: rychlá izolace, stabilizace a zakoncentrování. Purifikační techniky: afinitní chromatografie iontoměničová chromatografie hydrofóbní chromatografie Rychlost Column: rProtein A Sepharose Fast Flow, XK16/20, bed height 4.8 cm (9.6 ml Sample: 600 ml clarified cell culture containing 87.6 mg of lgG2a Starting buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 Elution buffer: 20 mM sodium citrate, pH 4.0 Flow rate: 5 ml/min (150 cm/h) V. 2.0 1.5- 1.0- :: - o.o-J 0 200 400 600 Volume (ml) Fig 4.5. Example of capture step: Purification of IgG, from clarified cell culture. Další purifikace proteinu Cíl: Dále separovat a zakoncentrovat cílový protein. Rozlišení Purifikační techniky: iontoměničová chromatografie hydrofóbní chromatografie Rychlos Kapacita Výtěžek Column: Sample: Buffer A: Buffer B: Flow rate: Gradient: XK 16/20 Butyl Sepharose 4 Fast Flow S ml of partially purified Annexin V expressed in E. coli 20 mM Sodium phosphate, pH 7.0.1 M {NHJ2SOa 20 mM Sodium phosphate, pH 7.0 100 cm/h 0 to 50% B, 20 column volumes V tomto kroku se využívá eluce kontinuálními gradienty. Tento krok není vždy potřebný. —I— 0 60 Time [min) Fig 4.7. Example of an intermediate purification step: Purification of recombinant Annexin V by HIC. Dočistení proteinu a úprava podmínek pro jeho skladování (pH, soli, additiva) Cíl: Zisk produktu o požadované vysoké čistotě. Odstranění stopových kontaminací, odstranění velmi podobných proteinů, fragmentů či agregátů cílového proteinu Rozlišení Rychlost Purifikační techniky: gelová permeační chromatografie Kapacita Výtěžek Column: Sample: Buffer: Flow rate: 10 ■ XK16/60 packed with Superdex 75 prep grade 1.0 ml of partially purified ZZ-brain IGF 300 mM ammonium acetate, pH 6.0 0.5 ml/min (15 cm/hi monomeric ZZ-Brain IGF K odstranění molekul stejné velikosti je třeba využít jiných možností purifikace jako iontoměnič nebo hydrofóbní chromatografii. Fraction 1 3 5 0 12 3 4 Time(h) Fig 4.9. Example of polishing step: removal of dinners and multimers by GF. His-tagged protein purification 1 krok 2 kroky 3 kroky Buffer éäľhan^o to prepare far IEX. IH i f ■ a p DeísM n?,. HiPrep 26/10 Desalting carumns? Steps in circles are optional and are appfied if nc-ctEE.arv ©Buffer PKtri a rcge to rpmovp imidazole or salts. iPO-IO Desalting. HiTrap Desalting calumrisf 0 Concentration for sample voJ-u-me reduction. May a I so tie performed before SEC. (Vivaspmm SampSE Concentrators] Základní zásady pro pořadí purifikačních kroků Typical characteristics Purification phase Method Resolution Capacity Capture Intermediate Polishing Sample start conditions Sample end conditions AC +++ or ++ +++ or ++ +++ ++ + Various binding conditions Specific elution conditions IMAC +++ ++ +++ ++ + For purifying histidine-tagged proteins using Ni Sepharose columns:: 20-40 mM imidazole; pH > 7; 500 mM NaCI; no chelators Other proteins: low concentration of imidazole High concentration of imidazole, pH > 7, 500 mM NaCI GF ++ +■ + +++ Most conditions acceptable, limited sample volume Buffer exchange possible diluted sample IEX +++ +++ +++ +++ +++ Low ionic strength. pH depends on protein and IEX type High ionic strength or pH changed HIC +++ ++ ++ +++ +++ High ionic strength, addition of salt required Low ionic strength Základní zásady pro pořadí purifíkačních kroků • Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením —» velké množství levného vstupního materiálu. • Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná —» ve vzorku již investovaná práce, množství proteinu je menší. • Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků, jako je výměna pufru mezi jednotlivými separačními technikami příklad: po precipitaci síranem amonným nebo iontoměničové chromatografii (protein je eluován z kolony za vysokých koncentracích soli) zařadit hydrofóbní chromatografii (vzorek dávkován na kolonu ve vysoké koncentraci soli) • Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat. v • Cím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu a rychlost purifíkace. Fúzní proteiny Translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a a) krátký peptid [př. (His)n, (Asp)n, (Arg)n ... ] b) přirozený Oligopeptid [př. MBP, GST, thioredoxin ...] - expresní plazmidy obvykle obsahují různé tagy/kotvy - umístění na N- i C- konci proteinu plt-JZ.,1-1 T7 promoter T7 transcription \t.itt Tr\»T.ifi 11 xliiiK m'.|uiti. i- I !:'■•" i.- . •■ In;-.. .|ii. r■ ! icoding sequeno Multiple cloning shcs VrH : \/n< I H Is »Tag coding sequence T7 ■--■■■-:= ■■- i loci coding ■-■ 111 ■ ■! i ■ pBR322 origin f'i.i coding u -1 i ■ .■ ■ fl origin 327 344 249-293 ifiH >\i HU ä .( 26-72 1171-2250 3684 44455302 '-J.il iHffi The maps, for pfcT32bl+) and pET 32c(*) are the uim as pET-32a(+) (shown) with the-following exceptions: pKT3?b(-| Ua 5899bp pL&mld snbtrjct I bp from r.x h site beyond hVi/wU 1 ai 138. pET 32t (-) Is a 590lbppbsmid. add ]bp lo each site beyond Ki/ipH 1 at 198 except Tor ttvR V which cuts ai 209 BssHII mi HpahAJT) BspLUH kXU) Bst1107 MMJ] rihtil l-uif, li"T-»] JSaL SC * *" C***C***CCCC 'CC !CCUA"ICGAJ GtyfelLrliluThrllaftloAlaLyaPhMiK Wool EotfVtaH I fafl I Sac I . .»Tcmtc"C'o:ic'cc'ccc»ccccc"C' ■>Sil'< «■■ i" v I" iJ»r5»-ü vt«uVo »'s«- oC ■ vS«- ► S-T»w»ii*fi$»at3 -„__-1- _ fijf Ii V»' I thrombin ■ .1; .i .».; li . -, ■ , . , ■I ;iwc*Tccco:'cc-ii pfJT-sM* C»«ks:CCGUftCGUCC'GlCMGaiQCraCCKCGCIS«GCl* -.»■--..»■ <'•■.<.«..*. «» Di Fnw PS933T-3 pET-32a-c(+) cloníng/espression region Proč využívat tágy? > Zvýšení výtěžku rekombinantního proteinu > Možnost detekce proteinu > Lokalizace - signální sekvence pro transport proteinu > Usnadnění purifíkace rekombinantního proteinu Fúzní partner Velikost Umístění Využití His-tag 6, 8, or 10 aa N- or C-terminus Purification, detection Thioredoxin 109 aa(11.7kDa) N- or C-terminus Purification, solubility enhancement Calmodulin-binding domain (CBD) 26 aa N- or C-terminus Purification Avidin/streptavidin Strep-tag 8 aa N- or C-terminus Purification, secretion Glutathione ^-transferase (GST) 26 kDa N-terminus Purification, solubility enhancement Maltose binding protein (MBP) 396 aa (40 kDa) N- or C-terminus Purification, solubility enhancement Green fluorescent protein (GFP) 220 aa (27 kDa) N- or C-terminus Localization, detection, purification Poly-Arg 5-16 aa N- or C-terminus Purification, solubility enhancement N-utilization substance A (NusA) 495 aa (54.8 kDa) N-terminus Solubility enhancement Zvýšení výtěžku rekombinantního proteinu Tágy zvyšující výtěžek jsou proteiny nebo peptidy zapojené do: > Zvýšení účinnosti iniciace translace (př. GST, MBP, NusA...) - Výhoda N-terminálních tagů - Poskytují spolehlivou sekvenci pro účinnou iniciaci translace > Ochrany před proteolytickou degradací > Pomáhají při skládání (foldingu) proteinu a zvyšují tak rozpustnost cílového prot Zlepšení rozpustnosti rekombinantních proteinů Kotvy/tagy zvyšující rozpustnost y N -terminálni tagy > Spíše proteinové (vysoce solubilní proteiny) než peptidy > Fúze se solubilním partnerem často pomáhá fúznímu partnerovi se správně poskládat, což vede ke zlepšení rozpustnosti cílového proteinu y Nemají univerzální efekt y Mechanismus, jakým působí není plně objasněn Some commonly used solubility-enhancing fusion partners Tag Protein Source organism M BP Maltose-binding protein Escherichia coli GST Glutathione-S-transferase Schistosoma japonicum Trx Thioredoxin Escherichia coli NusA N-Utilization substance Escherichia coli SUMO Small ubiquitin-modifier Homo sapiens SET Solubility-enhancing tag Synthetic DsbC Disulfide bond C EschercNa coli Skp Seventeen kilodalton protein Escherichia coli T7PK Phage T7 protein kinase Bacteriophage T7 GB1 Protein G B1 domain Streptococcus sp. ZZ Protein A IgG ZZ repeat domain Staphylococcus aureus Generate parallel expression clones Dead end: insolubility His6 I GST]—Target protein His6 ^NusA)—[Target protein His6 (MBP Target protein His6 [ Trx J— Target protein Protease cleavage site His6 MBP Target protein IMAC FT SUCCESS Target protein Good cleavage (b) Purify by IMAC Cleave with protease Poor i cleavage (to His6 (NusAl—Target protein His6 (NusA) Target protein Dead end: protein insoluble after cleavage of tag Dead end: difficult to separate cleaved protein from lusion Current Opinion in Biotechnology Esposito and Chatterjee, 2006 Schéma exprese a purifikace za použití solubilitu zvyšujících kotev. (Esposito and Chatterjee, 2006). Tágy zvyšující rozpustnost - mechanismus působení Příklady možných mechanismů Maltose binding protein (MBP) se pravděpodobně váže reverzibilně na exponované hydrofóbní oblasti nově vznikajících polypeptidů a pomáhá tak polypeptidu získat nativní konformaci mechasnismem podobným chaperonům. NusA zpomaluje translaci tím, že zprostředkovává transkripění pauzy, což může pomoci správnému poskládání cílového proteinu. Negativně nabité tágy (peptidy) - dochází k elektrostatickému odpuzování mezi nově vynikajícími polypeptidovými řetězci, čímž se inhibuje jejich agregace (Zhang et. 2004). Thioredoxin - oxidoreduktáza Rychlá redukce intra- i inter- molekulárních disulfidických vazeb. Thioredoxin slouží jako kovalentně navázaný chaperon nezávisle na redoxní aktivitě. Fúzní kotvy (tágy) využívající se k puľifikaci Kotva (tag) Typ chromatografie Princip separační techniky Poly [His] afmitni vazba na kov IgG vazná doména afmitni vazba na protilátku Poly [Asp] iontoměničová vazba na anion vázající matrici Poly [Phe] hydrofóbní vazba na hydrofóbní matrici Strep-tag afinitní vazba na streptavidin Poly [Arg] iontoměničová vazba na kation vázající matrici Metalochelatační afinitní chromatografie • R.1975- uveřejnil Porath a kol. metodu frakcionace sérových proteinů. • Konstrukce umělých oligohistidinových domén (poly [His]) fúzovaných k N-nebo C- konci proteinu metodami molekulární biologie. • Nyní jeden ze základních purifikačních postupů rekombinantních proteinů. •Interakce proteinu s matricí je zprostředkovaná neobsazenými d-orbitaly iontů přechodných kovů, které vážou volné elektronové páry převážně z dusíkového atomu imidazolových skupin histidinových zbytků v proteinu. Ligand (Ni*). oddělovací Funkční/reaktivní skupina Podpůrná matrice (agarosa) Matrice pro metalochelatační afinitní chromatografii \ (M^ „oddělovací I raménko" Protein s histidinovou \m \_\x \ J f kotVOll VVVV" \ CH— CH, II ■ ^7 Funkční/reaktivní skupina Podpůrná matrice (porózní polysacharidové částice- agarosa) „oddělovací raménko" y Snížení stérických zábran a umožnění optimálního navázání rekombinantního proteinu na imobilizovaný ligand / inefficient binding target el oteš during binding and fllutwn ~i-r 10 15 20 25 Elirtion volume, ml \ Efficient binding target e lutes in 3 singlů peak n r=-1- 10 15 20 25 Elutioo volume, ml Fig. 56. Using spacer arms, a) Ligand attached directly to the matrix, b) Ligand attached to the matrix via a spacer arm. Efekt kovového iontu navázaného na matrici M (kDa) 170 ■ 116 ■ 86 ■ 56 ■ 27 20 -(HisíeZm-peO.r Zn2+ Ni2+ Co2+ Cu2+ Síla vazby: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~ Co2+ Metalochelatační afinitní chromatografie Puriflkace za nativních podmínek >Pufry o pH 7-8 pro optimální navázání rek. proteinu na kovovým iontem v matrici > Pufry s vysokou koncentrací solí (0.5-1 M NaCl) - redukce nespecifických elektrostatických interakcí. >Neiontové detergenty a glycerol redukují nespecifické hydrofóbní interakce. y Eluce kontaminujících proteinů se dosahuje snížením pH nebo nízkou koncentrací imidazolu. > Eluce cílového His-tagového proteinu je dosažena při vysoké koncentraci imidazolu (0-0.5 M), větším snížením pH nebo přídavkem EDTA. Immobilized metal affinity chromatography Hisn protease cleavage site PROTEIN charged metal chelate resin I PH I imidazole] Ír ) [EDTA] t\ Me" protease + Target protein v:3 100 30 40 :■■;> AjdolmAUl 4000 3000 2000 1000 Target protein - K 60 AC 0 10 20 30 40 50 60 Fig 2.3. Typical IMAC purification with gradient elution. 0 5 10 15 20 25 30 35 Volume Imll 70 Volume Imll Fjg 2 A Typjc0| imac purification with step elution. Metalochelatační afinitní chromatografie Purifikace za denaturačních podmínek Denaturační IMAC — purifikace proteinů v inkluzních tělíscích ^^^^ Purifikace za vysokých koncentrací močoviny nebo guanidinium chloridu -► čistý protein, ale porušení kvartérní struktury (postačí však např. na imunizace) Zisk nativního konformeru: - Nutné pro měření enzymové kinetiky, rtg analýza,... - Eluce proteinu z kolony a jeho renaturace dialýzou nebo výrazným zředěním v renaturačních pufrech (pufr podporující správné složení proteinu) - Renaturace enzymu vázaného na matrici: Gradient z denaturačních do renaturačních pufrů Pulzní renaturace Odstranění fúzních kotev Jakýkoliv tag může ovlivnit biologickou aktivitu proteinu, může bránit proteinu krystalizovat, zvyšuje proteinovou velikost (protein je pak např. příliš velký pro NMR), proteiny se mohou stát imunogenní díky tágu (problém u terapeutických proteinů). Možnosti odstranění fúzních kotev > Chemické štěpení > Samoštěpení > Enzymatické štěpení Odstranění fúzních tagů-chemické štěpení > Používá se nejméně Brom kyanid Met/X Hydroxylamin Asn-Gly 1 I MRGSHHHHHH M12 M15 / / GMASMEKNNQ M28V / GNGQGHNVPN 40 I DPNRNVDENA NANSAVKNNN NEEPSDKHIK EYLNKIQNSL STEWSPCSVT ^M105V CGNGIQVRIK PGSANKPKDE LDYANDIEKK ICKVEKCS Amino - acid sequence of the P. falciparum C-terminal segment of CSP (PfCSP C-ter) fused to a purification tag (Rais-Beghdadi et al, 1998). > Nešetrná metoda > Velmi účinná > Spíše nespecifická > Může vést k denaturaci a modifikaci cílového proteinu Odstranění fúzních tagů - samoštěpení > Použití tzv. samo- štěpícího se tágu Inteiny I XH-i'1 Intsin C-Exlem □ NA: FINA: transcription translation precursor protein COOH Protein; V- Protei n: Nlls_ ^ protein splicing Inteiny (inteins, /fiíervening protein*) jsou proteinové segmenty, které mají schopnost se samy vyštěpit z proteinových prekurzorů. > Vnesením mutací na N- nebo C- konce inteinu vznikly tzv. samoštěpící tágy odvozené od inteinů (štěpí se pouze na jenom místě). mature pr&teňt rJrwscí intein rA pH intein N <0 pH 6.0-6.5 20-25°C, 16 h A pH intein N 4. C Thiol intein A 15-30 mM thiol -i 4"C,16 h 49 -I- C- Thiol intein A{ Perler, (2005) Odstranění fúzních tagů - proteolytické štěpení Specifické proteolytické štěpení: > Exopeptidázy > Endopeptidázy Exopeptidázy (aminopeptidázy and karboxypeptidázy): DAPase (TAGZyme) Aeromonas aminopeptidase Aminopeptidase M Carboxypeptidase A C arbox) peptidase B Exo(di (peptidase Exopeptidase Exopeptidase Exopeptidase Exopeptidase Cleaves N-terminul. His-lat; i(. -terminal i lor purilication and removal Cleaves N-terminal, effective on M, L. RequiresZn Cleaves N-terminul. does not cleave X-P Cleaves C-terminal. No cleavage at X-R, P Cleaves C-terminal R. K >APM, CPA a CPB štěpí postupně pojedná aminokyselině z N- nebo C-konce proteinu až ke specifickému místu, které je signálem pro ukončení štěpení (stop site). TAGZyme system (Qiagen): > DAPáza (dipeptidyl aminopeptidáza I) TAGZyme stop sites Amino acid DAPase slop point (4-) sequence' Lysine (Lys. K) Arginire (Arg. ft) FVoline (Pro. P) Proline (Pro. P) Gklamino (Gin. Ql1 Xaa-Xaa. .Xea-Xu •i- Lys-Xaa ... Xm-Xml .Xm-Xm i Arg-Xaa ... Xaa-Xaa. .Xcia-Xaa •1 Xaa-Xaa FYo-Xaa. Xaii-Xa-a. XVia Xaa J- Xaa FVo Xaa-Xaa. Xafl-Xdcl. .X&a-Xaa i Gln-Xaa... DAPase cleavage DAPase stop MK HQ HQ HQ HQ HHP SDK HT-Tr\ HHP-Trx M 12 3 4 5 6 7 = = 4- HT-Trx *- HHP-Trx Arnau et al. Odstranění fúzního partnera - proteolytické štěpení Endopeptidázy > Štěpící místo pro endopeptidázy mezi fúzním tágem a cílovým proteinem. Cleavage site -^•^•^•v 1 ^it^B^ Protease Tag mL^^^p *~ ^9 ■ + ^^^^ time varies Enzyme Cleavage site Comments Enterokinase DDDDK* Secondary sites at other basic aa Fact 01 Xa IDGR* Secondary sites at GR Thrombin LVPR*CS Secondary sites. Bio tin labeled for removal of the protease Pre Scission LEVLFQ'GP GST tag for removal of the protease TEV protease EQLYFC/G His-tag for removal of the protease 3C protease ETLFQ*GP GST tag for removal of the protease Sortase A lpet'g Ca2+ -induction of cleavage, requires an additional affinity tag (e.g., his-tag) for on column tag removal Grunzyme B D^bTx.rvťN^X Serine protease. Risk for unspecific cleavage pRSET B Multiple Cloning Site T7 promoter RBS 21 AATACGACTC ACTATAGGGA GACCACAACG GTTTCCCTCT AGAAATAATT TTGTTTAACT TTAAGAAGGA Polyhistjdine (6xHisi region 91 GATATACAT ATG CGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT ATG GCT AGC ATG ACT Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Set Met Tht T7 gene 10 leader _Xpress1" Epitope_BsmH I Xho I Sac I GGT GGA CAG CAA ATG GGT CGG GAT CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GAT qCG AGC TCG Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Leu Tyr tAsp Asp Asp Asp Lys^sp Pro Ser Ser EK recognition site EK cleavage site Bgl II Pit I Pvu II Kpn I Nco I EcoR I SsIB I Hind III l II XI il, AGA TCT GCA GCT GGT ACC ATG GAA TTC GAA GCT TGA TCCGGCTGCT AACAAACCCC Arg Ser Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Glu Ala *** T7 reverse priming site 261 GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA ue 2üh Odstranění fúzních tagů - proteolytické štěpení > Nespecifické štěpení - produkt štěpení je doporučeno vždy ověřit pomocí MS analýzy. > Optimalizace proteolytického štěpení fúzního proteinu (poměr enzym substrát, teplota, pH, koncentrace solí, délka štěpení, modifikované proteolytické enzymy) > Po odstranění tágu může docházet k precipitaci cílového proteinu. > Účinnost štěpení (může být snížena kvůli stérickým efektům nebo agregaci - vložení krátkých linkerů mezi proteázové místo a fúzní tag) > Re-purifikační krok nutný pro oddělení cílového proteinu od fúzního tágu > Modifikace cílového proteinu (po štěpení některými proteázami, např. thrombinem, TEV, Precision zůstává jedna nebo dvě aminokyseliny připojené k cílovému proteinu. Enterokináza Asp-Asp-Asp-Asp-Lys/X Table 4 Cleavage (%) of e nterokinase through densitometry (Hosfield and Lu 1999) based on the amino acid residue Xi. The sequence....-(iSDYKDDDDK-Xi-ADQLTEEQIA-... of a GST-cal- tnodulin fusion protein was tested using 5 nig protein digested with 0.2 Uof enterokinase for 16 h at 37 °C Amino acid in pos ition X| Cleavage of enterokinase {%) Alanine 88 Methionine 86 Lysine 85 Leucine 85 Asparagine 85 Phony lalaninc 85 I so leucine 84 Aspartic acid 84 Glutamic acid Nil Glutamine 79 Valine 79 Arginine 78 Threonine 78 Tyrosine 78 Histidine 76 Serine 76 Cysteine 74 Glycine 74 Tryptophan 67 Proline 61 His-tagged protein and IMAC under native conditions One-step purification of maize ß-glucosidase > Perfusion matrix: POROS MC/M > Functional group: iminodiacetate, metal ion Zn2+ > Removing contaminated proteins: linear gradient of imidazole (0-50 mM) and pH (pH 6.1-7) > Protein elution: 0.1 M EDTA > 80% recovery, 95 fold purification > Common production and isolation of wild type protein and soluble mutant form for enzymatic measurements and crystallization. M (kDa) I-1 A B C D (Zouharetal, 1999) Purifikace proteinu AHP2 (Arabidopsis histidin phosphotransfer protein 2) Metalochelatační afinitní chromatografie /Pufr: 50 mM Tris pH 7.9, 300 mM \ NaCI, 10 % glycerol, 20 mM \ imidazol, 3.9 mM merkaptoethanol \ Gradientova eluce: 20 -500 mM \ imidazol \ Gelová permeační chromatografie Pufr: 20 mM Tris pH 7.9, 250 mM NaCI Isokratická eluce Anion výměnná chromatografie Pufr: 20 mM Tris pH 7.9 Gradientova eluce: 0 - 1M NaCI 66 kDa 45 kDa 36 kDa 29 kDa 24 kDa 20 kDa 14 kDa 15% SDS PAGE 10% NATIVE PAGE - 15 % SDS PAGE 10% NATIVE PAGE His-tagged protein and IMAC under native conditions Four-step purification of Arabidopsis C KI1 RI) 1. Affinity purification (IMAC) 2. Tag removal (TEV protease) 3. Affinity purification (IMAC) 4. Size exclusion chromatography Ub- SGSG- HisTaq- SA-" rEV- AME-( :kii 3. Affinity purification after TEV cleavege -CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml Mi 8 2011:10 UV -CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradienti 8 08 2011:10 Cone -CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradientiB OS ?011 10 Frartinns----CKI1RD Hi Trap Chelating 5 ml linear gradienti 8 OS ?01110 Injer.l CKI1 RD pETM-60:lXIl 0 rhM imidaz^ 200 mM imidazole ■H.N.N.H411H2I MJBkMJá m WW I1H2I WW I1ÍH2I WW ht^l I pETM-60::CK 1^ pETM-60 4. Size-exclusion chromatography J Ul LJ LUXU-LILU Ul IJ 1 -10-20 mgforTB and M9 Pekařova B.