—Cílem: získat DNA v nejvyšší kvantitě a kvalitě — —Ideální izolační postup: -1) co nejvyšší separační účinnost – odstranit maximum látek vyjma NK -2) co nejvyšší výtěžnost – zisk veškeré přítomné DNA (! malé množství DNA) -3) převedení do stabilního stavu — —1) lýze buněk – voda, pufr —2) denaturace bílkovin – proteináza K, DTT, teplota —3) přidání alkoholu – zamezení degradace DNA + PK (deaktivuje DNázy a RNázy) —4) „DNA je molekula s parciálním záporným nábojem“ vazba na pevnou fázi – zafixována na nosiči —5) odmytí buněčných debris – wash buffers —6) změna složení roztoku (snížení koncentrace solí, změna pH z kyselého na zásadité, teplota) - zrušení vazby DNA na nosič a její uvolnění do roztoku — — Silikátové kolonky – DNA zachycena na kolonce během centrifugace (případně vakuovým odsátím) lyzátu, pak přečištěna a následně uvolněna do čistého elučního roztoku. — — Magnetosilikové partikule – DNA vázána na paramagnetické kuličky, které mohou být manipulovány pomocí magnetu – např. vyjmuty z roztoku, přeneseny do přečišťovacích roztoků a z nich nakonec do elučního roztoku, kde je DNA uvolněna. — Typ vzorku Množství DNA Tekutá krev 2000 ng/ml – 4000 ng/ml Krevní stopa 250 ng/cm2 – 500 ng/cm2 Tekuté sperma 150000 ng/ml – 300000 ng/ml Post-koitální vaginální stěr 10 ng/stěr – 3000 ng/stěr Vytržený vlas (s cibulkou) 1 ng/cibulku – 750 ng/cibulku Vypadený vlas (s kořínkem) 1 ng/cibulku – 10 ng/cibulku Tekuté sliny 1000 ng/ml – 10000 ng/ml Stěr dutiny ústní 100 ng/stěr – 1500 ng/stěr Moč 1 ng/ml – 20 ng/ml Kost 3 ng/ml – 10 ng/ml Tkáň 50 ng/ml – 500 ng/ml —komerční kit x chemikálie z laboratoře x mix —? vstupní materiál (trusiči a netrusiči, degradace DNA, vlhké prostředí, expozice vnějším vlivům, …) —? jeden kit / postup na vše —? opakovatelnost/srovnatelní množství vyizolované DNA — — Komerční kity (validace a testovací studie provede výrobce x situace u soudu, DNA free, kontaminace výrobcem ověřitelná) — —vzorek s předpokládaným velkým množstvím DNA (bukální stěry) – 5% chelex, Swab solution — —vzorek – stopy (s malým množstvím DNA a degradované stopy) - - Blood Mini kit, Investigator kit (QIAGEN), IQ systém (Promega) — —stopy po daktyloskopickém zkoumání – Prepfiler (AB) — —kostní tkáň a zuby – Prepfiler, alkoholová metoda — —směsné vzorky ( mravnostní TČ) – diferenciální lýza — —vzorky ošetřené formalinem — — —pro sběr, transport, archivaci a izolaci nukleových kyselin při pokojové teplotě. Karty typu FTA® obsahují chemikálie, které lyzují buňky, denaturují proteiny a chrání nukleové kyseliny před nukleázami, oxidací a poškozením od UV záření - zajištění tekutého materiálu —předpoklad: tekutá krev a bukální stěry —realita: tekutá krev —- Mikro karta typu FTA® - jedna vzorkovací — plocha pro aplikaci až 125 µl plné krve —výhody: rychle inaktivují organismy, včetně krevních patogenů a brání růstu bakterií a dalších mikroorganismů, minimální nároky na uskladnění —Chelex® 100 -Chelex je pryskyřice složená ze styren divinylbenzen kopolyméru obsahující párové iminodiacetátové ionty. Tyto ionty působí chelatačně a váží polyvalentní kovové ionty. Pro izolaci DNA je především důležité vyvazování Mg2+ iontů, které jednak jsou nezbytné pro aktivitu nukleáz (např. DNáz degradujících DNA) a je tedy nezbytné je tímto způsobem inaktivovat, a také tyto ionty při vysoké teplotě (95-100°C) mohou vést k poškození DNA. Principem izolace je homogenizace vzorku, destrukce buněčných komponent alkalickým prostředím a vysokou teplotou a separace roztoku obsahujícího DNA od zbytků buněčných komponent a pryskyřice chelexu. -bukální stěr + 1 ml dd H2O; centrifugace – vznik peletky; odpipetování tekutiny; přidá se 1 ml 5% roztok chelexu, 30 min. při 56 °C, 10 min. při 95 °C -!!! Chelex je na dně, DNA ve vodné fázi v horní části zkumavky — — — stabilní roztok obsahující DNA chelatační činidlo vyvazující enzymatické kofaktory —Swab Solution (Promega) -možnost izolovat z FTA karty i z BS -součástí balení: 100 ml SwabSolution™ Reagent a 500 μl 5X AmpSolution™ Reagent -postup: 1 ml SS ke vzorku, 30 min. při 70 °C – nosič zůstává v eppendorfce!!! -skladování při 4 °C -při amplifikaci ke 2 ul izolátu nutno přidat 5 ul 5x AmpSolution Reagent - —Izolace pomocí kolonek -QIAamp DNA Mini Kit -Investigator kit -QIAamp Fast DNA Tissue Kit — —Izolace pomocí magnetických partikulí -PrepFiler® Forensic DNA Extraction Kits -EZ1 Investigator kit -DNA IQ Promega - — — Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky —izolace ruční/robot (QIAcube) —vhodný na krev a tkáně —finální objem 50 – 150 µl —The QIAamp Fast DNA Tissue Kit využívá nově kombinace mechanismů chemické a enzymatické lýzy. Každý kit obsahuje ocelové kuličky a speciální tvar kolonek napomáhá procesu izolace. Nejprve se přidá vzorek a mix reagencií a pouhým votexováním dochází k uvolnění DNA z buněk. Celý proces izolace trvá cca 30 min. https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/qiaamp-fast-dna-tissue-kit/#prod uctdetails —EZ1 Advanced a BioRobot EZ1 umí atomatizovanou purifikaci jaderné DNA na bázi silikomagnetických partikulí. Odpadají kroky centrifugace a najednou lze v závislosti na přístroji izolovat až 14 /resp. 6 vzorků najednou. Přístroj je během izolace zavřený/zamčený, nelze jej otevřít , čímž je eliminováno riziko kontaminace. —S využitím nově navržených paramagnetických partikulí lze s tímto kitem připravit vzorky pro STR analýzu a to velmi jednoduše a efektivně. DNA IQ™ System lze použít k extrakci DNA z různých typů vzorků, včetně bukálních stěrů, tekuté krve a FTA karet. https://www.youtube.com/watch?v=5wqs7IlEz7M&t=84s —PrepFiler® Forensic DNA Extraction Kits – obvyklé forenzní vzorky včetně „tekutých vzorků“, stěry tělních tekutin, cigaretové nedopalky, žvýkačky, dopisní známky a lepenky… — -lyzační pufr a DDT (k rozrušení vnitromolekulových i mezimolekulovách disulfidických můstků, které stabilizuj tercirní a kvartertní strukturu proteinů) -dle typu materiálu délka inkubace a teplota (tělní tekutiny- 20 min., suché vzorky a stěry (bukální i stěry na slepo)- 40 min., čisté sperma - 90 min. -po inkubaci přidání „kuliček“ - vazba DNA na ně -promytí -uvolnění DNA z nosiče -50 ul izolátu DNA — - - - —PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit -místo lyzačního pufru se přidává BTA pufr, PK a DTT, změna teploty inkubace -stačí pilkou nařezat plátky – použití pilin je dostačující — — — Fenol choroformová metoda -klasickým způsobem izolace DNA, tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA -obecný postup: rozrušení působením proteinázy, se postupně přidává fenol či směs fenolu a chloroformu, které z lyzátu vyváží proteiny - -kostní moučka inkubována s 20 ml roztoku EDTA SARCO s proteinázou K při 55°C 24 hod., poté výměna roztoku a následovala další 24 hod. inkubace – dokud se moučka nerozpustila -přidáno 20 ml fenol/chloroform/izoamylalcohol (25:24:1), 20 ml chloroform/izoamylalcohol (24:1), extrakce DNA opakována 3x, - -přidáním těchto látek k vodnému roztoku dojte k separaci roztoku do dvou fází: horní fáze je vodný roztok obsahující DNA; spodní je pak organická fáze fenolu či chloroformu -mezi vodnou a organickou fází se hromadí proteiny - -koncetrováno pomocí Centriplus YM-100 kolonek na výsledný objem 150 ul Silica-based DNA extraction - vycházelo se z Qiagen Blood Maxi kit - kostní moučka byla inkubována s 15 ml ATL pufr, 10 mg proteinázy K a 300 ul DTT po dobu 24 hod. při 56°C ve vodní lázni - přidáno 14 ml AL pufr a následovala inkubace při 70°C na 10 min. - supernatant přenesen do 50 ml zkumavky, přidáno 22 ml EtOH 96% a postupně byl obsah přenesen na kolonu 50 ml zkumavky - omytí 10 ml pufru AW 1 a 10 ml pufru AW 2 DNA eluce pomocí AE - koncentrace eluátu pomocí Centriplus YM-100 kolonek na výsledný objem 150 ul —- směs ženských epiteliálních buněk a spermií – typicky u vzorků poševního stěru po znásilnění —- oddělení ženské a mužské frakce vzorků (rozdělení původního smíšeného vzorku na separátní vzorky obou původců materiálu) —- užití „měkčích“ a posléze „tvrdších“ lyzačních podmínek (zatímco ženské epiteli podléhají lýze snadno, spermie jsou mnohem odolnější) —1) v mírně lyzačním roztoku rozrušeny a spolu s roztokem odebrány ženské epitelie —2) v silně lyzujícím roztoku rozrušeny spermie — —Differex™ Systém (Promega) -pomocí automatu – výrazné zkrácení doby izolace — Obsah obrázku text, interiér Popis byl vytvořen automaticky —vysoce pokročilá technologie mikromanipulace, užívaná v nejrůznějších oborech pracujících s biologickým materiálem —vyhledávání příslušných objektů (např. buněk) v mikroskopu, jejich oddělení od ostatního materiálu pomocí laserového paprsku a přenesení světelným pulzem do čisté zkumavky —např. jednotlivé spermie z poševního stěru, embryonální buňky z potratu apod. — — pomocí laserového paprsku jsou vyříznuty požadované buňky (např. spermie) pomocí světelného pulzu jsou vyříznuté buňky přeneseny do víčka zkumavky —1. Zajištění tkáně z parafínového bločku (odstranit část parafinu tak, aby se odhalila přímo zájmová oblast tkáně, část tkáně nařežeme na tenké plátky) — —2. Odstranění parafinu (xylén) — —3. Rehydratace tkáně (100 % , 70 % a 50 % EtOH) — —4. Rozložení tkáně (ATL pufru) — —5. Izolace DNA (fenol chloroformové metoda, QIAamp DNA mini) — — — — Izolát DNA – finální produkt izolace DNA; jedná se o vodný roztok DNA (tj. ředidlem je voda) nebo roztok pufru a DNA (v izolátu mohou být přítomny i další látky, např. soli, které DNA stabilizují) — — Inhibitory – látky nejrůznější povahy s negativním účinek na průběh jednoho ze zásadních kroků analýzy – PCR; jejich přítomnost ve vzorku může vést ke zhoršené kvalitě výsledků analýzy či k jejímu úplnému selhání —- během průběhu izolace – alkoholy, fenol, některé typy detergentů. —- původ přímo ve vzorku (přítomny už v původním biologickém materiálu, který je dodán do laboratoře ke zkoumání) — — Inhibitor PCR Pravděpodobný zdroj Hemoglobin (hemin) Krev Melanin Tkáň, vlasy Polysacharidy Rostlinný materiál Žlučové soli Výkaly Huminové kyseliny půda Močovina Moč Indigové barvivo Jeansovina Kolagen Tkáň Myoglobin Svalová tkáň Vápníkové ionty Kosti, zuby — přečištění izolátu DNA — účinné odstranění inhibitorů, případně dalších nežádoucích látek, které zůstaly ve vzorku přítomny i po izolaci —inhibitory původem z krevních vzorků – potlačení jejich negativních účinků až v průběhu PCR – přidáním BSA (bovinní sérový albumin) —použití kitů s magnetickými partikulemi – odmytí inhibitoru v průběhu izolace (AB) —QIAamp MinElute spin kolonek (Qiagen) —Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) — — — —snížení objemu izolátu při zachování veškeré DNA —„zahuštění“ roztoku —u vzorků s malým obsahem DNA —postup: -1) vyvázání DNA z roztoku na pevnou fázi (např. SiO2) a její následné uvolnění do roztoku o menším objemu -2) centrifugace pomocí tzv. mikrokoncentrátorů – velmi husté sítko, které propustí pouze rozpouštědlo a drobné molekuly, makromolekuly DNA však ne – zůstanou zachyceny a opět mohou být uvolněny do roztoku o menším objemu, než měl původní izolát -vakuová odparka – koncentrátor vodný, etanolový a vysoký tlak vodní páry; okolí, 30°C, 45°C, 60°C —