— —cíl: stanovit množství DNA — — —Spektrofotometrická kvantifikace DNA —- určení množství veškeré DNA ve vzorku bez ohledu na to, z jakého zdroje tato DNA pochází —- molekuly DNA silně absorbují elektromagnetické záření vlnové délky 260 nm (tj. ultrafialové záření) —- paprsek o 260 nm se nechá procházet roztokem DNA (např. izolátem) a změří se pokles intenzity záření – tím větší, čím je roztok DNA koncentrovanější — Po průchodu kyvetou poklesne intenzita světla (část je ho pohlcena roztokem v kyvetě) SVĚTELNÝ ZDROJ DĚLICÍ HRANOL SPEKTRÁLNÍ FILTR KYVETA S ROZTOKEM CCD DETEKTOR —Cíl: stanovit množství DNA? — — —Spektrofotometrická kvantifikace DNA -určení množství veškeré DNA ve vzorku bez ohledu na to, z jakého zdroje tato DNA pochází. - molekuly DNA silně absorbují elektormagnetické záření vlnové délky 260 nm (tj. ultrafialové záření) -paprsek o 260 nm se nechá procházet roztokem DNA (např. izolátem) a změří se pokles intenzity záření – tím větší, čím je roztok DNA koncentrovanější - — NESPECIFICKÁ A PRO FORENZNÍ ÚČELY NEVHODNÁ - — -chemické sloučeniny - barviva (např. EtBr, PicoGreen, OligoGreen) – vazba na/do DNA - změna jejich prostorového uspořádání; při dopadu světla určité vlnové délky fluorescenčně aktivní – vyzařování světla, jehož množství je měřeno fluorimetrem -„Množství vyzářeného světla je přímo úměrné množství navázaného barviva, a to je zase přímo úměrné množství DNA přítomné ve vzorku.“ — Na/do DNA se naváže fluorescenční barvivo CCD DETEKTOR SVĚTELNÝ ZDROJ Po excitaci laserem navázané fluorescenční barvivo září Čím více je DNA ve vzorku, tím více barviva se naváže a tím více vzorek září: -chemické sloučeniny - barviva (např. EtBr, PicoGreen, OligoGreen) – vazba na/do DNA - změna jejich prostorového uspořádání; při dopadu světla určité vlnové délky fluorescenčně aktivní – vyzařování světla, jehož množství je měřeno fluorimetrem -„Množství vyzářeného světla je přímo úměrné množství navázaného barviva, a to je zase přímo úměrné množství DNA přítomné ve vzorku.“ -relativně vysoká citlivost a přesnost měření, malé nároky na spotřebu vzorku, možnost měření automatizovat, nízká cena analýzy -nespecifita měření — — PRO FORENZNÍ ÚČELY NEVHODNÁ —testovací sondy nasedají na Alu sekvence —Alu sekvence – specifické pro lidskou DNA a vyšších primátů —hybridizace sondy - cíl iniciuje sérii enzymů - reakce, které končí oxidací luciferinu a produkcí světla —intenzita světla se odečítá pomocí luminometru a je úměrná množství DNA přítomnou ve vzorku —množství DNA ve vzorku se stanoví porovnáním na standardní křivku —rozsah 0,1 až 50 ng — —? VHODNÝ PARAMETR (délka cca 300 bp x degr. DNA, vypovídací hodnota o kvalitě, resp. kvantitě DNA) — —nepracuji se známým vzorkem x biologie potvrdila přítomnost lidského biol. materiálu (vyjma AluQuant kitu) —neznám přesnou historii vzniku stopy —čas vzniku stopy a doba uplynulá před zajištěním —neznám klimatické podmínky —nevím kolik osob se mi na vytvoření stopy podílelo —neznám strukturu podkladu/kontaminace, inhibitory Kvantifikace – stanovení množství DNA ve vzorku, resp. určit množství "amplifikovatelné" DNA - důležité pro vyladění PCR Potřebuji znát více parametrů: -množství lidské DNA -poměry XX a XY -degradaci - inhibici —- PCR a současně průběžně měřeno množství PCR produktů – podle toho, jakým způsobem během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní vstupní množství DNA ve vzorku (kalibrace pomocí vzorků známé koncentrace) -vysoce přesná, vysoce citlivá, přísně specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) -detekce případné přítomnosti PCR inhibitorů a rozsah DNA fragmentace -detekce pomoci SYBR Green -FRET sondy („fluorescent resonance energy transfer“) – TaqMan, „molecular beacon“ („molekulární maják“) — — —- PCR a současně průběžně měřeno množství PCR produktů – podle toho, jakým způsobem během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní vstupní množství DNA ve vzorku (kalibrace pomocí vzorků známé koncentrace) -vysoce přesná, vysoce citlivá, přísně specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) -detekce případné přítomnosti PCR inhibitorů a rozsah DNA fragmentace -detekce pomoci SYBR Green -FRET sondy („fluorescent resonance energy transfer“) – TaqMan, „molecular beacon“ („molekulární maják“) — — —Taq Man sondy — —Quantifiler (AB) – Q Duo a Q Trio - — —Plexor HY, PowerQuant (Promega) — — —Investigator Quantiplex Pro RGQ Kit (Qiagen) — — — —https://www.youtube.com/watch?v=LgrfCKp6vB0 — — https://www.youtube.com/watch?v=LgrfCKp6vB0 Q – 1 target o délce 63 bp Q Duo - Q Trio - [USEMAP] —délka amplikonu „autosomal DNA“: 84 bp (robustní x inhibitorům) —Y chromozóm: amplikony 81 bp a 136 bp —degradace: 294 bp —IPC: 435 bp - inhibice — [USEMAP] —detekce : TaqMan probes - QuantiNova DNA Polymerase —koncentrace DNA: 200 ng/µl až 0.5 pg/µl, s citlivostí menší než 0.1 pg/µl —citlivost zachycení mužské DNA ve vzorku s výrazně vyšší koncentrací ženskou DNA (400,000 : 1) —DNA Degradation Control (DC) - detekce degradace jak „male“ DNA tak i „total human“ DNA —IC (internal control) je citlivější k inhibitorům — —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymerázy. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — volné nukleotidy enzym polymeráza primerový pár F R 96°C cílové místo primeru F cílové místo primeru R start PCR —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymerázy. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — cílové místo s navázaným primerem R cílové místo s navázaným primerem F 72°C 95°C —Polymerázová řetězová reakce —Princip obou metod/kroků stejný — — — — —Denaturace - DNA se po dobu 20–30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. —Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. —Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymerázy. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 75-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA. — — cílové místo s navázaným primerem R cílové místo s navázaným primerem F 72°C 95°C [USEMAP] ü PCR inhibitory ü nesprávné složení PCR reakční směsi – nedostatečná koncentrace dNTPs, Mg2+, primerů či DNA polymerázy; příliš vysoká koncentrace Mg2+ ü vyšší než optimální hybridizační teplota – ani specifické primery se „neudrží“ ü vstupní množství templátové DNA ü nesprávné nasednutí primerů, nesprávné složení PCR reakční směsi, příliš nízká anelační teplota - snížení specifity reakce ü chyby při činnosti polymerázy – zařazení nesprávného nukleotidu, prokluz polymerázy („stutter“) — ünamnožení zájmových lokusů před provedením dalších analýz (SNP lokusů, HVR mtDNA apod.) üjeden z více kroků nějaké analýzy (mono- či multiplexová PCR jako součást analýzy STR lokusů, asymetrická PCR jako součást sekvenace HVR mtDNA apod.) ü ümonoplexová PCR – amplifikace pouze jediného lokusu v jedné reakci s použitím jednoho páru primerů ümultiplexová PCR - amplifikace více lokusů v jedné reakci s použitím většího počtu páru primerů (duplexová, triplexová PCR apod.) ü üsymetrická PCR – oba primery v rámci primerového páru přidány do reakce ve stejném množství ünesymetrická PCR – preference kopírování v jednom směru přidání jednoho primeru ve větším množství — http://www.distribio.com/img/instruments/abi9700_1.jpg — —DNA: struktura a funkce —marker /znak– lokus - alela — autozóm x gonozóm, počet chromozómů a jejich struktura —mitózou a meiózou – rekombinace, mutace —rozdíl mezi sekvenčním a délkovým polymorfismem — — —polymorfismus délky restrikčních fragmentů —štěpení restrikční endonukleázou EcoRI —pokud místo obsahuje — rozpoznávací sekvenci dojde — ke vzniku fragmentu — extrakce DNA — štěpení pomocí restrikčních endonukleáz — separace pomocí elektroforézy — Southernův přenos – přenos fragmentů z gelu na nylonovou membránu —hybridizace komplementárních radioaktivně nebo chemoluminiscenčně značených sond ke specifickým sekvencím DNA — hodnocení radioaktivního filmu —použity v původní Jeffreysově metodě —jedna sonda se váže k mnoha lokusům obsahující VNTR polymorfizmy —vzniká obraz připomínající čárkový kód —umožnění personální identifikace, ale v případě směsných vzorků velmi špatná interpretace —minisatelity: 10 - 100 bp —marker D1S80 — - délka 16 bp opakování 16 -41 x — —!!!Ne každý minisatelit je VNTR!!! — — —https://www.youtube.com/watch?v=5S_GBfxvymI —detekovány pouze jedna (homozygot) nebo dvě (heterozygot) alely — —https://www.youtube.com/watch?v=9bEAJYnVVBA —mikrosatelity: 2 – 10 bp dlouhé úseky —opakování: 5 – 50 x —nekódující oblasti DNA nebo v intronech, 3 % genomu – každých 10.000 nukleotidů 1 STR — — — —D16S539 —D: DNA —16: chromosome 16 —S: single copy sequence —539: 539th locus described on chromosome 16 — — — — —PowerPlex® ESX 17 System —The PowerPlex® ESX 17 System amplifies the loci recommended by the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) and European DNA Profiling Group (EDNAP) as mini-STRs (<125bp; D2S441, D10S1248 and D22S1045) or midi-STRs (125–185bp; D1S1656 and D12S391). — —PowerPlex® ESI 17 Pro System —The PowerPlex® ESI 17 Pro System is designed to amplify six of the original seven European Standard Set (ESS) loci (D3S1358, D18S51, TH01, vWA, D8S1179 and the more common FGA alleles) along with D16S539 and D19S433 as smaller amplicons (<250bp), while the loci recommended by the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) and European DNA Profiling Group (EDNAP) (D1S1656, D2S441, D10S1248, D12S391 and D22S1045) are present as larger amplicons. — — ESI 17 (Promega) PowerPlex® Fusion Systém 24 lokusový kit STR Kit Number of Loci PI* (N = 1036) GlobalFiler™ STR Kit 23 1.63 × 10–27 Investigator® 24plex Kit 23 1.63 × 10–27 PowerPlex® Fusion System 24 1.38 × 10–28 PowerPlex® Fusion 6C System 27 9.09× 10–31 —® Fusion System 6.58 × 10–29 —The Investigator ESSplex SE QS Kit uses QIAGEN's fast-cycling PCR technology for the simultaneous amplification of 16 STR markers and Amelogenin, as recommended by the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) and the European DNA Profiling Group (EDNAP) as the European Standard Set of loci (ESS). The Investigator ESSplex SE QS Kit Primer Mix contains the new innovative performance control Quality Sensor (QS1 and QS2). It provides additional information on sample quality and PCR success. The Quality Sensor, being simultaneously amplified with the STR markers, shows you if you are dealing with: —Successful PCR amplification —Failed PCR amplification —Absence of DNA —Degraded DNA —Inhibitors — —The additional information obtained with the Quality Sensor will help you streamline your sample analysis by showing you where to focus your analytical efforts, and save you time and money by eliminating the need for unnecessary PCR re-runs. — —The Investigator ESSplex SE QS Kit is designed specifically for rapid and reliable generation of DNA profiles from blood, buccal swabs, and forensic stains. The kit utilizes QIAGEN’s fast- cycling PCR technology, allowing amplification in approximately 60 minutes. It provides highly robust results with inhibitor-resistant chemistry. — — —ESS lokusy, SE33, DYS391 a Amelogenin, s Quality Sensor —bodové mutace s výskytem v populaci max. 95% stejné varianty —teoreticky 4 varianty, reálně 2 —s výskytem 1 SNP na 1000 bází v kódující i nekódující sekvencích —+ v genomu velmi početné, méně podléhají mutacím než mikrosatelity, relativně rovnoměrná distribuce po genomu, relativně snadná detekce —- poměrně nákladné získávání, polymorfismus omezený —