Sledování osudu buněk Experimentální embryologie > The strategy of the genes C.H. Waddington, 1957 Analýza buněčného osudu vs migrace •Sledováním buněčného osudu rozumíme analýzu potomků zkoumané buňky/buněk. Zajímá nás například, ve kterých orgánech či strukturách můžeme nalézt potomky zkoumané buňky, nebo jakým buněčným typům dává zkoumaná buňka vzniknout. •Velkým rozdílem oproti migračním analýzám (např. cell tracking) zde tedy je, že sledujeme potomstvo buňky. Tím pádem musíme počítat s dělením buněk a uzpůsobit tomu experimentální techniku. Vizuální metody sledování buněčného osudu •(historie, DiI a jiná barvení, transgenní přístupy (GFP, LacZ), Cre-Lox a Confetti systém) Historické přístupy •Jednoduše, přímé sledování ve světelném mikroskopu • • • • • • • • • • •Může to vypadat primitivně, ale už v 19. století byly takto položeny základy embryologie. Není k dispozici žádný popis fotky. Mapování C. elegans •Přímým pozorováním (live imaging) byl např. v roce 1983 zmapován osud všech buněk C. elegans 10.15252/msb.20145857. A picture containing text, screenshot, diagram, plot Description automatically generated Historické přístupy •Sledování nabarvených agarových zrnek •Aplikace na povrch nebo i dovnitř buněk A picture containing text Description automatically generated Vitální barviva •Cílem je, obarvit sledovanou buňku tak, aby se barva přenesla i na potomstvo, ale ne na sousední buňky. •Zároveň nesmí být barvou ovlivněn osud, chování a fungování buňky. •Klasickými příklady jsou DiI (indocarbocyanine) a DiO (oxacarbocyanine). Jedná se o lipid-solubilní barvy, která jsou schopny začlenit se do buněčné membrány a poté zesílí svůj signál. •Dále lze použít např. •fluorescenčně značený dextran (injekce dovnitř buňky) •HRP (Horseradish peroxidase) – opět injekce do buňky, po přidání substrátu produkuje světelný signál •Hlavní limitací těchto přístupů je riziko označení sousedních buněk a také postupné vyředění barvy s postupujícím dělením buněk. A picture containing screenshot Description automatically generated Transgenní přístupy •Principem těchto metod je, přenést do sledovaných buněk gen kódující barevnou značku – např. geny GFP a LacZ •GFP – Green Fluorescent Protein, po excitaci modrým světlem produkuje zelený světelný signál •LacZ – gen kódující enzym β-galaktosidázu, která po přidání X-galaktózy produkuje modrou barvu •Existuje několik způsobů vnesení genu do buňky, které se liší především trváním exprese tohoto genu •Transientní •Gen je exprimován pouze krátkodobě a nedochází k jeho stabilní integraci do genomu buňky, stále jej mohou zdědit dceřinné buňky, ale postupně se vyředí •Lipofekce, elektroporace, nebo mikroinjekce plazmidů •Stabilní •Gen je stabilně začleněn do genomu buňky a všechny dceřinné buňky jej zdědí •Virová transdukce Transientní vnesení genu Replikace DNA Stabilní vnesení genu A picture containing screenshot, reef Description automatically generated GFP značení LacZ značení Transplantace a využití chimér •Dalším „klasickým“ přístupem pro sledování osudu buněk jsou transplantační experimenty. Výhodou je, že většinou velice lehce odlišíme buňky hostitele a graftu od sebe – např. transplantace mezi různě barvenými mloky. •Podobně lze využít také chimér – embryí složených z více různých buněk. Nejprve izolujeme buňky z jednoho embrya a barevně je označíme, poté je smícháme s buňkami neznačeného embrya. •Nevýhodou těchto přístupů je, že se jedná o poměrně zásadní zásah do tkáně/organismu. A picture containing text, ground, outdoor, snow Description automatically generated FLP-FRT a Cre-Lox systémy A picture containing text, screenshot, line, number Description automatically generated A picture containing text, screenshot, parallel, diagram Description automatically generated •Typicky používán v Drosophile •Rekombinace vede k fúzi promotoru a reportérového genu, což spustí expresi reportéru •Typicky používán v myších modelech •Rekombinace vede k vystřižení STOP sekvence a spuštění exprese reportéru FLP-FRET a Cre-Lox systémy •U obou systémů je zásadní, že expresi rekombinázy lze řídit tkáňově nebo buněčně specifickým promotorem. To umožní rekombinaci a obarvení pouze ve vybraných buňkách. A picture containing text, screenshot Description automatically generated FLP-FRET a Cre-Lox systémy •Další možností je, použít heat-schock promotor nebo třeba Tamoxifen-inducibilní rekombinázu, což nám umožní vybrat si přesný čas/vývojové stádium kdy k rekombinaci dojde. Časové a místní řízení rekombinace lze navíc i kombinovat dohromady. •Příklad použití – sledování kmenových buněk v dospělosti. Specifický promotor nám směřuje expresi do kmenových buněk, Tamoxifenová indukce nám umožní „zapnout“ barevné značení až v dospělosti. FLP-FRET a Cre-Lox systémy •Další možností je, použít heat-schock promotor nebo třeba Tamoxifen-inducibilní rekombinázu, což nám umožní vybrat si přesný čas/vývojové stádium kdy k rekombinaci dojde. Časové a místní řízení rekombinace lze navíc i kombinovat dohromady. •Příklad použití – sledování kmenových buněk v dospělosti. Specifický promotor nám směřuje expresi do kmenových buněk, Tamoxifenová indukce nám umožní „zapnout“ barevné značení až v dospělosti. A close-up of a microscope Description automatically generated with low confidence Brainbow a Confetti mouse •Jedná se o modifikace Cre-Lox systému, kde dojde k náhodnému označení každé z buněčných rodin jednou barvou. Brainbow systém Confetti Bonus: DNA barcoding •S rozmachem sekvenačních technologií došlo k velkému posunu v oblasti tzv. „barcodingu“. •V podstatě jde o to, že do buněk se stabilně vnesou různé nekódující DNA sekvence, často v mnoha kopiích. Poté se v organismu exprimuje endonukleáza nebo rekombináza, která tyto sekvence cílí a změní je. Takto provedené změny v barcodových sekvencích jsou dědičné a každá buňka tedy přenese svoji unikátní kombinaci mutací (svůj barcode) na své potomky. Poté provedeme single-cell sekvenování a dokážeme složit dohromady kompletní mapu organismu. Free Barcode Generator | Cognex Bonus: DNA barcoding Zdroje •https://www.news-medical.net/health/Embryogenesis-Cleavage.aspx •https://www.facebook.com/AntiqueMicroscopes/ •10.15252/msb.20145857 •10.1242/dev.198994 •10.1016/j.cell.2012.01.002 •https://doi.org/10.1038/s41592-018-0185-x •