Experimentální embryologie Bi1130 3D kultury – jejich využití jako alternativní experimentální model Mgr. Marek Hampl, Ph.D. 2023 Bi1130 – 3D kultury2 3D kultury – Osnova přednášky ̶ Základní typy a charakterizace ̶ Organoidové kultury ̶ Příprava a kultivace ̶ Charakterizace organoidů ̶ Příklady využití v bazálním a klinickém výzkumu Bi1130 - 3D kultury3 Smysl 3D kultury ̶ vytvoření 3D in vitro modelové kultury za účelem vývoje tkáním a orgánům podobných konstruktů ̶ konstrukty s podobnou strukturou a funkcí jako reálná tkáň či orgán ̶ schopnost vytvářet různé buněčné typy, které spolu interagují ̶ využití v bazálním i klinickém výzkumu ̶ částečné nahrazení zvířecích modelů (in vivo) a 2D buněčných kultur Bi1130 - 3D kultury4 Typy 3D kultur organoidy sféroidy Cell-laden biomimetic constructs Organs-on-chips (Lukonin et al.) (RND Systems) (Davoodi et al. 2020) (fluidix.com) Bi1130 - 3D kultury5 Co rozumíme pod pojmem organoid? ̶ historie využívání organoidů – relativně nová metoda publikovaná poprvé v roce 2009 ̶ miniaturizované verze tkání resp. orgánů ̶ organoidy vytvářejí trojrozměrné struktury v in vitro podmínkách ̶ organoidy by měly vykazovat strukturu co nejvíce podobnou reálnému orgánu včetně mikroanatomie a tvorby specifických molekul ̶ vlastnosti: pozor na rozdíly mezi organoidem a sféroidem Jaké jsou rozdíly mezi organoidem a sféroidem? Bi1130 - 3D kultury6 Organoid vs. Sféroid – základní rozdíly původ progenitorové buňky buněčné agregáty složení všechny typy buněk orgánu jeden typ nebo některé typy buněk orgánu/tkáně forma morfologická a fyziologická příbuznost s orgánem částečná a krátkodobá organizace buněk doba kultivace dlouhodobá krátkodobá prostředí kultivace Matrigel, kolagen spontánní formace organoid sféroid Crown Bio Bi1130 - 3D kultury7 Sféroidy ̶ buňky v suspenzní kultuře se spojují (agregují) a vytvářejí kulovité útvary = sféroidy ̶ pojem sféroid poprvé použit v roce 1971 (používány již dříve) ̶ dochází k samovolnému spojování buněk – ze samostatných buněk vznikají mnohobuněčné útvary (přirozené pro vývoj) ̶ uvnitř sféroidu dochází k interakcím mezi jednotlivými buňkami ̶ průchod kultivačního média difúzí – čím větší je sféroid, tím hůře proniká do hlubších vrstev ̶ využití ve výzkumu – nádorová biologie, transplantační biologie, testování léčiv A New Dimension of Cell Culture: The Rise of Spheroid Culture Systems. 2019. Bi1130 - 3D kultury8 Jednoduchá charakterizace sféroidu ̶ určení morfologie pomocí světelného mikroskopu bez specifického značení: ̶ průměr a objem ̶ vnější morfologie ̶ integrita ̶ translucence – kompaktnost sféroidu ̶ rychlost růstu Cytosmart: Spheroids: properties, image analysis, and culture methods. Steward, 2020. Bi1130 - 3D kultury9 Tvorba sféroidů – typy kultivace ̶ Hanging drop – jedna z nejstarších metod (1907) ̶ kapka buněčné suspenze s definovanou buněčnou denzitou ̶ aplikace na kultivační plastik, otočení vzhůru nohama ̶ kapka drží díky povrchovému napětí, buňky se vlivem gravitace shlukují ve spodní části kapky a agregují ̶ jednoduchost a nízká cena Penfornis et al. 2017. Front Bio Bi1130 - 3D kultury10 Tvorba sféroidu – další typy kultivace ̶ Magnetic levitation – smíchání buněk s magnetickými částicemi a vystavení působení magnetických sil – vznik agregátů ̶ Spinner culture – neustálé míchání kultury vede k agregaci buněk ̶ Pellet culture – buňky jsou „donuceny“ ke kontaktu centrifugací Ryu et al. 2019. Cells Bi1130 - 3D kultury11 Cell-laden biomimetic constructs ̶ určeno pro tkáňové inženýrství a transplantace ̶ buněčná suspenze v gelovité extracelulární matrix (tzv. mikrogely) ̶ navození strukturní a funkční charakteristiky tkáně či orgánu Feng et al. 2019. Adv Func Mat Příklad: Regenerace chrupavky ̶ mikrogel – upravená hyaluoronová kyselina (HA-VS) v kombinaci s upravenou želatinou (Gel-SH) ̶ smícháno s kostními mezenchymovými kmenovými buňkami (BMSCs) – vytvoření gelových kapének se zapouzdřenými buňkami ̶ in vitro a in vivo testování Bi1130 - 3D kultury12 Organs-on-chips ̶ mikrofluidní zařízení pro kultivaci buněk v mikrometrových komorách s neustálým prouděním média ̶ modelování fyziologických funkcí tkání a orgánů, testování léčiv ̶ Jednoduché – jedna perfuzovaná komora, jeden buněčný typ, pozorování specifických funkcí jednoho typu tkáně ̶ Složené – více spojených perfuzovaných komor, každá komora jeden buněčný typ, pozorování ovlivňování buněčných typů navzájem – interakce mezi tkáněmi ̶ VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=0jf6Tor9WtA Wu et al. 2020. BMC Biomed Eng Bi1130 - 3D kultury13 Multi-organ-on-a-chip (human-on-a-chip) ̶ více typů buněk různých tkání propojených kanály („cévy“) – integrace různých orgánů do systému ̶ 2 orgány (střevo, játra) ̶ 3 orgány (střevo, játra, kůže) ̶ 4 orgány (střevo, játra, kůže, ledvina) ̶ 10 orgánů (střevo, játra, kůže, ledvina, slinivka, plíce, srdce, svaly, mozek, děloha) Organs-on-chips. Microfluidic reviews. Bi1130 - 3D kultury14 Vznik organoidové kultury ̶ organoidy poprvé využity pro modelování růstu střevních krypt (Sato et al. 2009. Nature) ̶ není systém kultivace udržující základní fyziologické vlastnosti střevních krypt → izolace kmenových buněk střeva (Lgr5+ buňky, Barker et al. 2007. Nature) ̶ použití specifických faktorů při kultivaci = vznik střevní krypty z jedné kmenové buňky Faktory: R-spondin (Wnt agonista, sebeobnova) EGF (proliferace epitelových buněk) Noggin (zvýšení množství krypt) matrigel s lamininem (zabraňuje anoikis) Sato et al. 2009. Nature Bi1130 - 3D kultury15 Základní typy organoidů ̶ organoidy se vytvářejí díky schopnosti samoorganizace a diferenciace kmenových buněk ̶ byly vytvořeny organoidy pro různé typy orgánů – tenké a tlusté střevo, játra, ledviny, plíce, prostata, slinivka, žaludek, děloha, mozková kůra, retina, atd. Regnard and Hammers, 2020. ̶ dva typy organoidů v závislosti na použití vstupních kmenových buněk: ̶ derivované z dospělých orgánově specifických kmenových buněk (ASCs) ̶ derivované z pluripotentních kmenových buněk (PSCs) – embryonální (ESCs) a indukované pluripotentní (iPSCs) Bi1130 -3D kultury16 Podmínky pro vznik specifických organoidů ̶ nezbytná součást kultivačního média – tkáňově specifické růstové faktory ̶ různé typy organoidů se vyvíjejí a diferencují v závislosti na přidaných růstových faktorech ̶ závislost použití růstových faktorů na původu kmenových buněk ̶ Příklad: Játra ̶ PSCs: BMP↑, FGF↑ ̶ ASCs: BMP↓, FGF↓, Wnt↑, TGF↑, HGF↑, EGF↑, ROCK↓ Tortorella et al. 2021. Eur Bioph J Bi1130 - 3D kultury17 Způsoby přípravy organoidů ̶ příprava organoidů může probíhat dvěma způsoby a oba způsoby mohou být navíc kombinovány v závislosti na potřebách experimentu: Jaké jsou základní rozdíly v přípravě a jaké jsou výhody a nevýhody použitých způsobů přípravy? Příklad: Metodika přípravy mozkových organoidů ̶ neřízená (unguided) metoda přípravy – spontánní diferenciace a morfogeneze SCs ̶ řízená (guided) metoda přípravy – indukce SCs do specifické buněčné linie pomocí suplementace růstových faktorů Qian et al. 2019. Development Bi1130 - 3D kultury18 Neřízená (unguided) příprava organoidové kultury ̶ založeno na schopnosti diferenciace a spontánní morfogeneze PSCs ̶ organoidy rostou v ECM, sami se organizují do mozkových částí na základě vnitřní signalizace ̶ vznik heterogenní tkáně – přední, střední a zadní mozek, choroidní plexus, sítnice, … ̶ spontánní diferenciace způsobuje náhodnou variabilitu Qian et al. 2019. Development Výhoda: komplexní tkáň, navzájem se ovlivňující buněčné typy Nevýhoda: nepředvídatelný poměr jednotlivých buněčných typů, heterogenní uspořádání tkání sítnice choroidní plexus ovlivnění ovlivnění Bi1130 - 3D kultury19 Řízená (guided) příprava organoidové kultury ̶ diferenciace a morfogeneze PSCs ovlivněna přidáním specifických růstových faktorů v raných fázích (možnost odstranění později) ̶ heterogenita tkáně regulovaná, vznik specifického regionu s danou funkcí ̶ možnost spojení specifických organoidů do asembloidů Qian et al. 2019. Development Výhoda: imitace in vivo vývoje daného typu regionu Nevýhoda: narušení komplexity vývoje tkáně - zanedbání podstatných vlivů na vývoj Bi1130 - 3D kultury20 Vznik asembloidů ̶ nová generace cerebrálních organoidů ̶ modelování interakcí mezi jednotlivými „částmi“ mozku Příklad: spojení mozkových organoidů ̶ vytvoření regionově-specifických organoidů → sledování vzniku nervových okruhů propojením morfologicky a funkčně různých organoidů Makrygianni and Chrousos. 2021. Front Physiol Bi1130 - 3D kultury21 Zajímavosti ze světa 3D kultur ̶ vznik nejen klinicky zaměřených organoidů ̶ porozumění biologicky zajímavým pochodům ̶ využití ve veterinární oblasti (hospodářství) ̶ Organoidy z jedových žláz hada vytvářející jed ̶ Organoidy ze střev hospodářských zvířat – skot, prase, králík, kůň, ovce, slepice ̶ „Xenoboti“ Bi1130 - 3D kultury22 Organoidy z hadích jedových žláz ̶ předchůdce organoidů – krátkodobé kultivace explantátů, suspenzní kultury, buněčné linie ̶ dlouhodobá kultivace – organoidy – sledování biologie jedové žlázy a složení jedu ̶ využitelné v tvorbě antiséra Post et al. 2020. Cell Bi1130 - 3D kultury23 Organoidy ve veterinární oblasti ̶ derivace z tkáňových kmenových buněk dospělců ̶ Prase – studium vstřebávání živin a interakce s patogenními mikroby (střevo) ̶ Kuře – fyziologie střeva, interakce s mikroorganizmy, absorpce léčiv ̶ Pes – vstřebávání léčiv ve střevě, keratinocytové organoidy (nemoci kůže), organoidy z nádorů prostaty a močového měchýře ̶ Kočky, koně, ovce,… Kar et al. 2021. Vet Res Prase Kuře Pes Bi1130 - 3D kultury24 NOVINKA – konec roku 2021: Xenoboti Xenoboti – samostateně se rozmnožující shluky buněk ze zárodku Xenopus laevis (Kriegmann et al. 2021. PNAS) ̶ uměle vytvořené shluky buněk původem ze zárodku žáby drápatky (pluripotentní buňky z animálního pólu embrya Xenopus laevis) ̶ schopnost samostatného rozmnožování - oproti ostatním mnohobuněčným organizmům nepotřebují k rozmnožování jiného jedince (vnitřní ani vnější povrch) ̶ podobné rozmnožování jako na subcelulární úrovni – nashromáždění extracelulárního materiálu a z toho vytvoření funkčních samostatně se rozmnožujících kopií ̶ VIDEO: https://www.pnas.org/content/118/49/e2112672118 Bi1130 - 3D kultury25 Kultivační prostředí – extracelulární matrix (ECM) ̶ organizace – buňky potřebují vnější prostředí co nejvíce podobné přirozenému ̶ zaručení možnosti buňkám organizovat se a rozrůstat se do trojrozměrného útvaru ̶ použití tzv. hydrogelů (vysoce hydratované polymerní materiály) ̶ přírodní nebo syntetické Kassis et al. 2019. Sci Rep ECM Bi1130 - 3D kultury26 Matrigel, Geltrex, Cultrex BME ̶ Bazální membrána z myšího sarkomu (Engelbreth-Hold-Swarm matrix) ̶ Různé obchodní názvy pro jeden typ ECM ̶ Kolagen IV, laminin, heparan sulfát, entactin ̶ Nevýhoda: špatně definovatelné složení, velká variabilita rozdíly mezi šaržemi, xenogenní původ (limit pro klinické aplikace) Bi1130 - 3D kultury27 Alternativa – přírodní hydrogely ̶ Matrigel – více než 1800 různých proteinů ̶ Definovatelné a stálé složení ̶ Alginát - biopolymer z hnědé řasy, podobnost živočišné extracelulární matrix, biokompatibilní ̶ Chitosan – polysacharid, výroba z chitinu (schránky korýšů) ̶ Kolagen – např. izolovaný kolagen I. typu z prasečích šlach ̶ Kyselina hyaluronová – HystemTM hydrogel Merck/Sigma Aldrich Bi1130 - 3D kultury28 Decelularizované hydrogely Decelularizovaná ECM určená k vytvoření gelu ̶ nejvýznamnější matrice podobné tkáním pro 3D kultivace ̶ velice podobné přirozené extracelulární matrix ̶ jednosložkové a kompozitní (obohacený např. o růstové faktory, enzymy, syntetické polymery…) hydrogely ̶ Příprava např.: odběr tkáně – decelularizace - vysušení mrazem a rozemletí – ozáření a enzymatické rozložení - neutralizace ̶ schopnost vytvořit gel, zachování struktury ECM, schopnost indukovat tvorbu organoidů Giobbe et al. 2019. Nat Comm Bi1130 - 3D kultury29 Decelularizovaná játra ̶ odstranění jaterních buněk promytím – není narušena struktura ̶ výborné výsledky v kultivaci jaterních organoidů ̶ lepší výsledky než při použití kolagenových ECM Baptista et al. 2011. Hepatology Bi1130 - 3D kultury30 Decelularizovaná střeva ̶ odstranění všech buněčných komponent promytím – není narušena struktura ̶ zachování lamininu a kolagenu II. typu po decelularizaci ̶ nestimuluje tvorbu střevních organoidů z ESCs → částečně diferencované střevní organoidy naopak vytvářejí typickou střevní morfologii Finkbeiner et al. 2015. Biol Open Bi1130 - 3D kultury31 Charakterizace organoidů ̶ charakterizace organoidové kultury v průběhu kultivace a po ukončení kultivace – sledování vlastností organoidů na makroskopické, mikroskopické a molekulární úrovni → určení specifické morfologie, exprese molekul a funkce pro danou tkáň (podobnost s reálnou tkání) ̶ Mikroskopie – bright field, skenovací a rastrovací elektronová mikroskopie ̶ Histologické preparáty – zpracování organoidů na histologické řezy ̶ Imunohistochemie – detekce proteinové exprese ̶ RNAScope – detekce genové exprese ̶ RNA-sekvenace – Bulk RNA-seq, Single cell RNA-seq Bartfeld and Clevers. 2017. J Mol Med Bi1130 - 3D kultury32 Mikroskopie ̶ Bright-field makroskopie/mikroskopie – jednoduché určení množství, velikosti, morfologie a rychlosti růstu organoidů Chua et al. 2019. Nat Cell Biol ̶ kombinovatelná s fluorescenční mikroskopií – použití fluorescenčních konstruktů (rozlišení pozorovaných organoidů od ostatních) Bi1130 -3D kultury33 Skenovací elektronová mikroskopie ̶ charakterizace povrchových struktur organoidu ̶ interakce buněk na povrchu organoidu, struktury na povrchu ̶ lumen – struktury vytvořené v dutině organoidu – řasinky ̶ organoid endometria Luddi et al. 2020. Cells Bi1130 - 3D kultury34 Transmisní elektronová mikroskopie ̶ charakterizace ultrastruktury organoidu ̶ kombinace ultratenkých řezů a velkého zvětšení ̶ sledování buněčných organel a buněčných produktů díky velkému zvětšení ̶ organoid endometria Luddi et al. 2020. Cells Bi1130 -3D kultury35 Histologické řezy ̶ Fixace ̶ Zalití do média ̶ Krájení histologických řezů ̶ Barvení (Haematoxylin-Eosin) ̶ sledování mikroskopické struktury organoidu – charakterizace základních buněčných typů ̶ porovnání s mikroskopickou stavbou skutečného orgánu Chua et al. 2019. Nat Cell Biol Bi1130 - 3D kultury36 Detekce genové exprese – In situ hybridizace (ISH) ̶ detekce genové exprese v organoidu střeva psa: ̶ detekce genové exprese LGR5 (červeně, intestinální kmenové buňky) ̶ porovnání exprese mezi tenkým střevem a střevním organoidem ̶ Princip ISH: přednáška - Metody detekce nukleových kyselin - Hampl Chandra et al. 2019. BMC Biol Bi1130 - 3D kultury37 Detekce genové exprese – RNAScope ̶ detekce genové exprese v organoidu střeva: ̶ RNAScope (červeně, markery zralých intestinálních buněk) ̶ Imunohistochemie (protein, zeleně lysozym – Panethovy buňky, Ascl2 – intestinální kmenové buňky) ̶ Princip RNAScope: přednáška - Metody detekce nukleových kyselin – Hampl ̶ Princip IHC: přednáška – Metody detekce proteinů - Harnoš Jung et al. 2018. Nat Comm Bi1130 - 3D kultury38 Detekce proteinové exprese – imunohistochemie (IHC) Chua et al. 2019. Nat Cell Biol ̶ detekce proteinové exprese v organoidu ̶ určení exprese tkáňově specifických proteinů (červeně) pomocí imunohistochemické metody a fluorescenční mikroskopie ̶ Princip IHC: přednáška - Metody detekce proteinové exprese - Harnoš Bi1130 - 3D kultury39 New generation sequencing (NGS) ̶ Jak efektivně určit změny v sekvenci nukleových kyselin, určit expresi specifických RNA molekul a případně rozlišit jednotlivé buněčné typy v heterogenní populaci buněk? ̶ tradičně – ISH, IHC, průtoková cytometrie – omezené množství molekulárních markerů, neefektivní Princip NGS: přednáška - Metody detekce nukleových kyselin – Hampl Single-Cell RNA-seq – určení genové exprese individuálně v každé buňce Bulk RNA-seq - určení celkové genové exprese v heterogenní populaci buněk Řešení? Bi1130 - 3D kultury40 Využití technologie organoidů ̶ podobnost orgánů s organoidy – využití organoidů jako nástroje v modelování a studování fyziologických funkcí a orgánových patologií ̶ Bazální výzkum: ̶ Vývojová biologie – embryonální vývoj orgánů ̶ Biologie tkání – homeostáza tkání a orgánů dospělců (obnova střevního epitelu) ̶ Klinický výzkum: ̶ Regenerativní medicína ̶ Modelování orgánových patologií ̶ Vývoj léků a personalizovaná léčba ̶ Organoidové assaye ̶ Centrum organoidových technologií Hubrecht Bi1130 - 3D kultury41 Využití organoidů ve vývojové biologii ̶ embryonální vývoj mozku ̶ vytvoření mozkového organoidu telencefala z lidských iPSCs ̶ obsahuje radiální glie (progenitorové buňky CNS) a specifické typy neuronů ̶ exprese genů typických pro telencefalon, geny typické pro jiné oblasti nejsou exprimovány ̶ studium vývoje lidského mozku a vývojových vad mozkové kůry Mariani et al. 2012. PNAS Bi1130 - 3D kultury42 Využití organoidů v regenerativní medicíně ̶ Regenerativní potenciál organoidů? ̶ Cesta k využití: 1. Transplantace organoidu do modelového organizmu daného onemocnění 2. Úspěch transplantace – vyléčení nebo prodloužení doby života organizmu 3. Potvrzení funkčnosti organoidu 4. Možné použití organoidu v regenerativní medicíně jako produktu tkáňového inženýrství, tzv. tkáňové grafty (štěpy, transplantáty) Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids in Regenerative Medicine. Lee and Son. 2021. Int J Stem Cells Bi1130 - 3D kultury43 Využití organoidů v regenerativní medicíně - játra In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Huch et al. 2013. Nature Bi1130 - 3D kultury44 Využití organoidů pro modelování orgánových patologií ̶ možnost modelování vývojových patologií i patologií dospělců ̶ vytvoření patologických buněk genetickými technikami nebo izolace přímo z pacienta ̶ kokultivace nádorových organoidů s periferní krví – stimulace tvorby T buněk ̶ ničení nádorových (plicních) organoidů autologními tumor-reaktivními T buňkami Dijkstra et al. 2018. Cell Bi1130 - 3D kultury45 Využití organoidů pro vývoj a testování léčiv a v personalizované léčbě Liu et al. 2021. J Trans Med ̶ vytvoření organoidů pro vývoj a testování léčiv a léčebných postupů – chemoterapie, radioterapie, imunoterapie ̶ možnost vytvoření tzv. patientderived organoids → personalizovaná léčba ̶ upravení léčby pro pacienty tzv. na tělo díky předchozímu testování léčiv na organoidech derivovaných z buněk pacienta ̶ možnost uchování ostatních organoidů pro případné další testování Bi1130 - 3D kultury46 Hubrecht Organoid Technology (HUB) ̶ Hubrecht Institute, Utrecht, Holandsko - místo vzniku prvního organoidu – Sato, Clevers ̶ patent na tvorbu organoidů z lidských tkáňově specifických buněk (ASCs) ̶ tvorba epiteliálních tkání Bi1130 - 3D kultury 47 Výhody a nevýhody využití organoidů ̶ Výhody: ̶ 3D oproti 2D buněčným kulturám ̶ Dlouhotrvající kultivace ̶ Nahrazení zvířecích modelů ̶ Velmi podobné reálným tkáním ̶ Možnost vytvořit téměř jakoukoliv tkáň ̶ Heterogenita – efekt léčiva na heterogenní populaci buněk ̶ Klonalita – tvořen z jedné buňky ̶ Nevýhody: ̶ Často nedostatečně prozkoumány a ověřeny charakteristiky ̶ Efekt hydrogelů z bazální membrány na chování buněk (přirozená diferenciace nebo náhodné přeprogramování?) ̶ nevhodnost pro studium nádorů (organoidy potřebují přichycení k podkladu, nádory ne) ̶ nádory in vivo jsou plné struktury, nádorové buňky vytváří duté organoidy (morfologie není stejná) ̶ nutnost čisté kultury – často jsou nádorové organoidy kontaminovány zdravými buňkami ̶ Heterogenita – objasnění mechanizmu působení léčiva v heterogenní oblasti ̶ Klonalita – musí být vytvořen z jedné buňky, při vysévání větší hustoty buněk problém ̶ Reproducibilita – heterogenita se liší mezi organoidy, těžko lze opakovat experimenty ̶ Mutace – nutnost určit kolik procent buněk nese mutaci (výsledný efekt účinku léčiva na které buňky) Bi1130 - 3D kultury48