Experimentální embryologie Bi1130 Metody práce s DNA a RNA – Analýzy genové exprese využívané ve vývojové biologii Mgr. Marek Hampl, Ph.D. 2023 Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii2 Osnova - Metody práce s DNA a RNA – Analýzy genové exprese využívané ve vývojové biologii ̶ Izolace nukleových kyselin ̶ Genotypizace ̶ PCR, qPCR ̶ PCR array, microarray ̶ RNA sekvenace, single cell sequencing ̶ In situ hybridizace ̶ RNAScope ̶ Kombinace proteinové a genové exprese Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii3 Izolace nukleových kyselin, historie ̶ nejzásadnější a výchozí proces pro použití molekulárně-biologických metod ̶ možnost izolovat DNA i RNA z různých biologických materiálů – živé nebo fixované tkáně či buňky Historie ̶ první izolace DNA – švýcarský lékař Friedrich Miescher v roce 1869 ̶ snaha o určení chemického složení buňky ̶ izolace buněk z lymfatických uzlin – špatná kvalita a nedostatečné množství ̶ leukocyty z použitých obvazů – vznik precipitátu po přidání kyseliny – zisk surové DNA ̶ separace jader a zbytku buněk – izolace tzv. nukleinu ̶ Richard Altmann – použití pojmu nukleová kyselina Friedrich Miescher Richard Altmann Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii4 Izolace nukleových kyselin pro potřeby vývojové biologie ̶ Izolace DNA – rekombinantní DNA konstrukty, chromozomální nebo genomová DNA ̶ Izolace RNA – mRNA, tRNA, rRNA, nekódující RNA – určení genové exprese ̶ Izolace pomocí přípravovaných chemikálií nebo pomocí předpřipravených komerčních kitů Izolace nukleových kyselin ve vývojové biologii? Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii5 Izolace DNA ve vývojové biologii ̶ tvorba plazmidových konstruktů v bakteriích a následná izolace (ovlivnění genové exprese) ̶ izolace DNA za účelem genotypizace mutantních experimentálních zvířat ̶ izolace pro DNA sekvenace nové generace Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii6 Izolace RNA ve vývojové biologii ̶ určování genové exprese (kvantifikace), porovnávání kontrolních a experimentálních skupin ̶ využití pro kvantitativní PCR, PCR Array, Microarray, RNA sekvenace Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii7 Genotypizace ̶ technika sloužící k určení genetických rozdílů (genotypu) vedoucích ke změnám ve fenotypu ̶ Krátké nukleotidové polymorfizmy (SNP) nebo velké strukturální změny v DNA ̶ Určení genotypu v kolonii zvířat – pro potřeby páření Cui et al. 2011. Cell Cycle Fyziologické změny vedoucí ke vzniku unikátních jedinců Patologické změny vedoucí k rozvoji onemocnění nebo vzniku vývojových vad Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii8 Genotypizace Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii9 PCR – Polymerázová řetězová reakce ̶ izolace RNA – extrakce mRNA z cílové tkáně, tkáňové kultury nebo buněčné kultury ̶ přepis do cDNA – tzv. reverzní transkripce – syntéza 1. vlákna komplementární DNA (cDNA) – vznik jednovláknové cDNA ̶ PCR – tvorba 2. vlákna cDNA – vznik dvouvláknové cDNA ̶ cyklus PCR: ̶ denaturace – rozpojení dvojvlákna ̶ annealing – navázání primerů ̶ prodlužování – zmnožení vlákna ̶ každé nově vzniklé vlákno slouží jako templát pro tvorbu dalšího vlákna – exponenciální amplifikace zápatí prezentace10 Kvantitativní PCR – qPCR/RT-PCR SYBR Green TaqMan Assay The Real time PCR Digest. 2016 Taher et al. 2011. PLoS One Příklad: Exprese Shh Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii11 PCR array ̶ Princip – kvantitativní PCR ̶ Hodnocení exprese desítek až stovek genů specifických pro určitý biologický proces ̶ Ideální pro porovnávání genové exprese menšího množství vybraných genů mezi kontrolním a sledovaným vzorkem (pacient, experimentálně ovlivněné buňky či živočichové) ̶ Výhoda – využití běžného PCR cycleru Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii12 PCR Array – RT2 Profiler ̶ Desítky různých genů ̶ Housekeeping geny ̶ Kontrola s genomovou DNA ̶ Kontrola reverzní transkripce ̶ Pozitivní kontroly Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii13 Specifické panely, specifické geny ̶ možnost použití pro různé živočišné druhy: ̶ člověk, myš, potkan ̶ kuře, zebřička, octomilka, prase, králík, pes, kráva, kůň, makak, … ̶ velké množství různých oblastí: ̶ Adipogeneze ̶ Angiogeneze ̶ Apoptóza ̶ Buněčný cyklus ̶ Embryonální kmenové buňky ̶ Hedgehog signální dráha ̶ Micro RNA ̶ Neurogeneze ̶ … Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii14 Postup metody ̶ buňky/tkáně/embrya ̶ Izolace RNA – přepis do cDNA ̶ Kvantitativní PCR ̶ Analýza – využití online vyhodnocení Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii15 Microarray ̶ detekce až tisíců různých genů na tzv. DNA, nebo také genovém chipu, nebo biochipu ̶ ideální pro porovnávání genové exprese obrovského množství genů mezi kontrolním a sledovaným vzorkem (experimentálně ovlivněné buňky či živočichové) ̶ nutnost opatření microarray scanneru, také možnost skenování chipů na některých sekvenátorech nové generace izolace a příprava vzorků kontrolní mutantní značení a navázání na chip kontrolní mutantní Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii16 Microarray - úvod ̶ použití tzv. DNA sond přichycených k pevnému povrchu (sklo nebo křemík) v daných pozicích ̶ jeden bod (DNA sonda) = jeden gen ̶ desítky tisíc genů na jednom chipu ̶ 4 typy DNA microarrayí: ̶ cDNA microarray ̶ Oligonukleotidová microarray ̶ BAC microarrays ̶ SNP microarrays Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii17 Microarray - princip ̶ přichycení fragmentované DNA na substrát a určení sekvence pomocí známé DNA sekvence ̶ Princip: hybridizace mezi vlákny nukleových kyselin na základě komplementarity bazí ̶ Hybridizace nukleové kyseliny o neznámé sekvenci na sondu o známé sekvenci Caminade et al. 2006. Sensors Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii18 Příprava a průběh cDNA microarray ̶ vzorky: kontrolní skupina a testovaný vzorek ̶ Aplikace na DNA chip ̶ Analýza a hodnocení Mutated cell Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii19 RNA sekvenace ̶ Co je cílem RNA sekvenace? ̶ určení množství a přesných sekvencí RNA pomocí sekvenace nové generace ̶ analýza tzv. transkriptomu – které geny v daném vzorku jsou do jaké míry aktivní Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii20 Aplikace RNA sekvenace ̶ určení transkriptů specifických genů a jejich sekvence, množství a kdy jsou aktivní – pochopení vývojových procesů a možných změn vedoucích k vývojovým vadám ̶ Použití: ̶ Transkripční profily buněčných typů ̶ Identifikace nukleotidových polymorfismů ̶ Diferenciální genová exprese – rozrůzňování buněk na základě aktivity specifických genů ̶ Alternativní splicing – produkce různých transkriptů z jednoho genu ̶ Odhalení posttranslačních modifikací – polyadenilace, capping ̶ Příklad: ̶ Odhalení funkce specifického genu – transkriptomika odhalí buňky a tkáně s expresí daného genu Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii21 Postup RNA sekvenace ̶ Izolace RNA ̶ Reverzní transkripce mRNA do cDNA ̶ Příprava cDNA knihovny – fragmentace, ligace, amplifikace ̶ cDNA sekvenace ̶ Alignment k referenčnímu genomu/transkriptomu a analýza dat ̶ Vytvoření RNA sekvenční mapy pokrývající transkriptom Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii22 Izolace RNA, reverzní transkripce Reverzní transkripce – přeložení z mRNA do cDNA mechanická nebo enzymatická izolace nebo kombinace Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii23 Příprava knihovny – fragmentace, ligace před reverzní transkripcí – fragmentace (vznik stejně dlouhých krátkých sekvencí mRNA) → následuje A-tailing Ligace adaptérových sekvencí Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii24 Tvorba klastrů, Bridge PCR illumina.com Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii25 Shrnutí přípravného procesu a následné RNA sekvenace VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii26 Alignment a analýza dat ̶ porovnání sekvencí ze sekvenace s referenčním genomem/transkriptomem Sudhagar et al. 2018. Int J Mol Sci Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii27 Single-cell RNA sequencing ̶ Bulk RNA-sekvenace – určení transkripčního profilu buněčné populace (zprůměrovaná genová exprese) ̶ Single-Cell RNA sekvenace – určení transkripčního profilu na úrovni jedné buňky ̶ Výhoda: ̶ určení cell-to-cell buněčné transkripční variability - rozrůzňování jednotlivých buněk v raném i pozdějším vývoji ̶ Odhalení vzácných buněčných populací Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii28 Bulk RNA-seq vs. Single cell RNA-seq Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii29 Cesta k Single-Cell RNA sekvenaci ̶ 1990 – amplifikace cDNA jedné buňky (in vitro transkripce a exponenciální amplifikace pomocí PCR), hematopoetické buňky, Iscove group ̶ 1992 – analýza genové exprese v jednom neuronu ̶ 2002 – 2010 – aplikace těchto technologií do DNA chipů ̶ 2009 – poprvé použita metoda Single-Cell RNA sekvenace na bázi sekvenace nové generace, charakterizace buněk raného vývoje (Tang et. al. Nature Methods) Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii30 Izolace – základní krok pro Single-Cell transkriptomiku ̶ A. ředění – izolace jednotlivých buněk postupným ředěním, neefektivní ̶ B. mikromanipulace – klasická metoda pro izolaci buněk z embryí, pomocí kapilárových pipet pod mikroskopem extrakce jednotlivých buněk ze suspenze, zdlouhavé a málo efektivní ̶ C. FACS – nejúčinnější strategie, označení buněk fluorescenční protilátkou – sortování specifické buněčné populace, nutnost velkého množství buněk na vstupu (více než 10000) Hwang et al. 2018. Exp Mol Med Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii31 Izolace – základní krok pro Single-Cell transkriptomiku ̶ D. laserová mikrodisekce – „vystřelení“ buňky z tkáně laserem ̶ E. mikrofluidika – ̶ F. magnetické částice a protilátky – Hwang et al. 2018. Exp Mol Med Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii32 Příprava Single-Cell cDNA knihovny ̶ tzv. droplet based library Illumina.com. Drop-Seq Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii33 In situ hybridizace ̶ Princip ̶ Příprava RNA sondy ̶ Příprava vzorků ̶ In situ hybridizace (ISH) na tkáňových řezech ̶ Whole mount In situ hybridizace (WISH) – kusy tkání nebo celá embrya Cela et al. 2016. Front Physiol Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii34 Princip metody – In situ hybridizace ̶ lokalizace a detekce specifické sekvence nukleové kyseliny v buňkách, v tkáňových řezech nebo v celých kusech tkání či celých zvířatech (embryích) ̶ vazba komplementárního řetězce nukleotidové sondy na specifickou cílovou sekvenci DNA či RNA ̶ značení sondy – radioaktivní, fluorescenční, enzymatické ̶ největší výhoda metody – lokalizace genové exprese vzhledem k specifickým buňkám a tkáním ̶ metoda poprvé použita v roce 1969 (Gall and Pardue, 1969. PNAS) Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii35 Hybridizace sondy na nukleovou kyselinu ̶ Cíl – určení přítomnosti nebo absence specifické sekvence (DNA nebo RNA) v buňkách nebo tkáních Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii36 Příprava sondy ̶ Odběr tkáně – izolace RNA – přepis do cDNA – PCR amplifikace ̶ Vložení do plazmidu – inzerce do bakterií ̶ Množení bakterií s plazmidy ̶ Linearizace plazmidu ̶ Syntéza próby ze značených nukleotidů ̶ Vytvoření značené próby Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii37 ISH WISH Vendrell et al. 2009. Gene Exp PattVölker et al. 2011. Histo Cell Biol vs. Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii38 RNAScope ̶ Využití k detekci genové exprese na tkáňových řezech ̶ Zaručení vysoké specifity díky využití nového systému kombinující specifické sekvence a amplifikátory ̶ Výsledná exprese zobrazena ve formě „teček“ ̶ Chromogenní i fluorescenční systém ̶ Manuální i automatizované verze Hampl et al. 2020. Front Cell Dev Biol Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii39 Princip RNAScope acdbio.com Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii 40 Kombinace detekce genové a proteinové exprese ̶ možnost zároveň detekovat specifickou genovou a proteinovou expresi v buňkách a tkáních ̶ kombinace použití protilátek a ISH RNA prób ̶ Využití kitu RNA-Protein Co-Detection Assays: VIDEO:https://www.youtube.com/watch?v=zEuk qfBDzMw&t=36s Jung et al. 2018. Nat Comm Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii41 Z jednoho tkáňového řezu histologická analýza, lokalizace exprese proteinu či RNA a navíc proteomové či genomové analýzy? Ano, to je možné!!! vzorek Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii42 NanoString – GeoMxR Digital Spatial Profiler VIDEO: https://www.nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview/ ̶ spojení histologických metod a genomických či proteomických metod ̶ použití parafinových i kryo řezů ̶ barvení proteinů či RNA – použití speciálních fotoštěpicích oligonukleotidů ̶ výběr oblasti nebo buněk ̶ z daných oblastí se provede expresní analýza Bi1130 - Metody analýzy genové exprese využívané ve Vývojové biologii43