J. Vondráček Interakce xenobiotik s DNA a proteiny DNA adukty • kovalentní adukty zprostředkovávají toxické účinky řady karcinogenů a cytotoxických látek; v případě DNA vedou její modifikace (tvorba aduktů, zlomů a ztráta bází) vést ke vzniku tzv. premutagenních lézí vedoucích ke vzniku mutací; • kovalentní modifikace biologických makromolekul karcinogeny byly poprvé pozorovány již v 50. letech; následně byly zkoumány mechanismy zodpovědné za reakce chemických sloučenin a jejich metabolitů s DNA a byly vyvinuty techniky umožňující citlivé stanovení specifických aduktů – využívány jak při studiu mechanismů toxicity, tak v molekulární epidemiologii; • vedle kovalentních modifikací dochází i k dalším typům poškození DNA – přímé účinky záření (UV, ionizující záření), nepřímé účinky zprostředkované tvorbou volných kyslíkových radikálů (ROS); • daná toxická látka může způsobovat více typů poškození DNA – typ poškození DNA může za určitých okolností sloužit k identifikaci zdroje poškození a identifikace zodpovědného toxikantu; směsi polutantů často způsobují velmi komplexní změny v DNA – příklad – expozice kuřáků; Příklad: Adukty DNA vznikající v důsledku expozice tabákovému kouři Int. J. Cancer: 131, 2733, 2012 Příklad: Endogenní DNA poškození Toxicol. Sci.: 120, S130, 2011 Metodika studia DNA aduktů • izolace DNA a její hydrolýza (nejčastěji enzymatická) – endonukleáza (štěpí DNA na oligonukleotidy) + exonukleáza (štěpí na jednotlivé deoxunukleotidy); nejčastěji se používá DNáza I a fosfodiesteráza – vznikají jednotlivé deoxynukleosid- 5’-monofosfáty; následně jsou působením alkalické fosfatázy připraveny nucleosidy; pro 32P-postlabeling se využívá kombinace mikrokokální nukleázy a slinivkové fosfodiesterázy - deoxynukleosid-3’-monofosfáty (metoda vyžaduje 5’-OH); • analýza, nejčastěji dvoukroková – nejprve jsou odděleny normální deoxynukleosidy od aduktů (odlišná hydrofobicita – C-18 RP kolona, Sephadex LH-20; extrakce 1-butanolem apod.); separace jednotlivých aduktů - HPLC, TLC; • detekce – radioaktivní značení, UV, fluorimetrie; 1) Polycyklické aromatické uhlovodíky Toxicol. Appl. Pharmacol: 206, 75, 2005 • Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) – významná skupina environmentálních polutantů – produkty spalovacích procesů; musí být bioaktivovány – metabolicky aktivovány prostřednictvím enzymů – tvorba ultimátních karcinogenů – dihydrodiolepoxidy; • tvorba těchto aktivních mutagenů/karcinogenů je stereospecifická a vyžaduje indukci/expresi CYP1 enzymů; 1) Polycyklické aromatické uhlovodíky Toxicol. Appl. Pharmacol: 206, 75, 2005 • benzo[a]pyren (BaP) – významný polutant, složka tabákového kouře; aktivován působením CYP1 enzymů a mikrozomální epoxidhydrolázy; ultimátní karcinogen vytvářející DNA adukty (primárně s deoxyguanosinem) – BPDE; BaP není karcinogenní v AhR KO myších: PNAS USA, 97, 779, 2000 1) Polycyklické aromatické uhlovodíky Toxicol. Appl. Pharmacol: 206, 75, 2005 • dráha radikálového kationu – alternativní dráha metabolické aktivace; tvorba BaP-chinonů – reaktivní toxické metabolity, oxidativní stres; 1) Polycyklické aromatické uhlovodíky Toxicol. Appl. Pharmacol: 206, 75, 2005 • tvorba o-chinonů – působení aldo-keto reduktáz (např. AKR1C3) – alternativní dráha metabolické aktivace; tvorba DNA aduktů vs. oxidativní stres? 1) Polycyklické aromatické uhlovodíky • substituované PAU nebo heterocyklické PAU mohou být metabolizovány alternativními dráhami – příklad – bioaktivace methylovaných PAU přes ester kyseliny sírové; Toxicol. Appl. Pharmacol: 206, 75, 2005 2) Vinyl chlorid Toxicol. Sci.: 120, S130, 2011 • vinyl chlorid je lidský karcinogen, který způsobuje jaterní angiosarkomy (expozice z povolání); je aktivován CYP2E1 na chlórethylen oxid, který tvoří 4 typy DNA aduktů, z nichž jen 3 (tzv. exocyklické adukty) jsou mutagenní; dochází k aktivaci K-ras genu i inaktivaci p53; silná mutagenita vychází z toho, že tyto exocyklické adukty blokují normální Watson-Crick párování bází; 3) Aflatoxin B1 • aflatoxin B1 je významný lidský hepatokarcinogen, mykotoxin produkovaný plísněmi rodu Aspergillus; vytváří dva hlavní typy aduktů 8,9-dihydro-8-(N7guanyl)-9-hydroxy-aflatoxin B1 (A), u kterého za fyziologických podmínek může dojít rozštěpení kruhu za vzniku 8,9-dihydro-8-(N5- formyl-2,5,6-triamino-4oxypyrimidin N5-yl)-9-hydroxy-aflatoxinu B1 (B). Tyto dva adukty byly identifikovány in vivo a tvoří cca 95% identifikovaných aduktů aflatoxinu B1; hlavn roli v jeho bioaktivaci hraje CYP3A4; Clin. Cancer. Res. 10, 4901, 2004 Mutat. Res. 402, 121, 1998 4) PhIP a heterocyklické aminy • tepelné zpracování masa vede k tvorbě řady účinných mutagenů – heterocyklických aminů. Významným zástupcem této skupiny je 2-amino-1- methyl-6-fenylimidazo[4,5b]pyridin (PhIP). • metabolická aktivace – Nhydroxylace, především působením CYP1A2 (v menší míře ostatní CYP1 enzymy a CYP3A4); • některé N-hydroxy metabolity jsou sice málo mutagenní, ale mohou být dále metabolizovány na vysoce mutagenní metebolitty protřednictvím esterifikačních reakcí; • karcinogenní v modelech nádorů kolonu a prostaty, mj. Apc mutace; DMD 29, 529, 2001 5) Chróm • sloučeniny Cr(VI) zvyšují riziko vzniku nádorů plic, mohu však také přispívat k rozvoji dalších typů nádorů, především v ústní dutině a v tenkém střevě; • primárním mechanismem přispívajícím ke karcinogenitě sloučenin Cr přímé poškození DNA prostřednictvím tvorby DNA aduktů nebo prostřednictvím tvorby ROS; • převládající formou jsou tzv. ternární L-Cr-DNA adukty, ve kterých atom Cr(III) spojuje DNA a malou molekulu, např. askorbát; Chem Res Toxicol. 21, 258, 2008 • nejzávažnějším typem poškození DNA ke kterému by mohla přispívat tvorba L-Cr-DNA aduktů jsou dvouřetězcové zlomy DNA vznikající v důsledku mismatch repair; Mutat Res 2011;711:61–72 Nucleic Acid Res 2007;35:465–76 5) Chróm DNA adukty a mutageneze Biochem. Pharmacol. 66, 1547, 2003 DNA adukty a mutageneze Cancer Lett. 332, 237, 2013 Nature Rev. Cancer 12, 801, 2012 Interakce xenobiotik s proteiny • v porovnání s tvorbou kovalentních aduktů xenobiotik s DNA jsou naše poznatky o interakcích toxikantů s proteiny mnohem limitovanější – několik důvodů – 1) struktura proteinů je mnohem složitější než struktura nukleových kyselin; 2) syntéza a degradace proteinů je mnohem dynamičtější proces než v případě DNA; • přesto v posledních letech vzrůstá pozornost věnovaná proteinovým aduktům, a to z několika důvodů: • 1) poškození proteinů může přispívat k cytotoxicitě – hlavní pozornost je v tomto případě věnována mechanismům toxicity léčiv a drog – acetaminofen, tamoxifen, halothan, kokain, cytostatika; • 2) poškození proteinů může přispívat k imunotoxicitě – rozvoj autoimunitních reakcí v důsledku kovalentních modifikací proteinů, vůči nimž pak organismus může tvořit protilátky (autoimunitní hepatitida, systémový lupus erythematodes, apod.); • 3) kovalentní adukty proteinů mohou být využívány jako specifické biomarkery expozice (např. léková toxicita, kouření, expozice bojovým chemickým látkám nebo insekticidům); • 4) specifické adukty mohou také vznikat v důsledku oxidativního stresu spojeného s lipidní peroxidací; Interakce xenobiotik s proteiny • hlavní cíle reaktivních molekul (elektrofilní sloučeniny) – funkční skupiny lokalizované v aminokyselinách: -SH (Cys); -NH (His); eNH2 (Lys); -OH (Tyr); • sterické faktory určují místa poškození proteinů – pouza místa vystavená solventům mohou být atakována elektrofilní sloučeninou; • detekce specifických aduktů – radioaktivně značená aktivní sloučenina – stanovení specifických proteinů; v posledních letech se však především rozvíjejí metodiky založené na kombinaci HPLC a hmotnostní spektrometrie; 1) Toxické proteinové adukty – příklad hepatotoxické účinky acetaminofenu • acetaminofen je běžně využívané antipyretikum a analgetikum (paracetamol), tvoří složku řady léčiv; • hlavním negativním vedlejším účinkem acetaminofenu je hepatotoxicita, která může mít fatální důsledky, v důsledku masivní nekrózy hepatocytů lokalizovaných centrilobulárně; vážný problém – např. v USA je ročně hospitalizováno 26.000 pacientů s předávkováním acetaminofenem a je registrováno 500 úmrtí; • toxicita souvisí s metabolismem acetaminofenu – detoxikace probíhá prostřednictvím konjugačních reakcí – acetaminofen-O-glukuronát, acetaminofen-O-sulfát; oxidativním metabolismem vznikají látky vytvářející proteinové adukty (zejména v mitochondriích – tvorba ROS – indukce nekrózy) Molecular Toxicology, 2nd ed., 2006Pharm. Res. 30, 2174, 2013 1) Toxické proteinové adukty – příklad hepatotoxické účinky acetaminofenu Pharm. Res. 30, 2174, 2013 N-acetyl-p-benzoquinonimin 2) Tvorba proteinových aduktů a imunotoxicita • poměrně málo prozkoumaná oblast; • předpokládá se, že toxikanty (jejich metabolity) vytváří proteinové adukty, které jsou následně štěpeny na peptidy prezentované MHC-I nebo MHC-II – tyto tzv. haptenované antigeny mohou být následně prezentovány Tlymfocytům; další možností je to, že v důsledku tvorby aduktu dojde ke změně proteinového místa dostupného pro proteolýzu – štěpním proteinu pak vznikají neobvyklé, tzv. kryptické peptidy, rozpoznávané jako nové antigeny imunitním systémem; • důsledkem je buď vznik alergických reakcí nebo autoimunitního onemocnění; příklad – alergické reakce na léčiva – např. penicilin; tyto imunitní reakce jsou reverzibilní – stačí eliminovat látku tvořící adukty; 2) Tvorba proteinových aduktů a imunotoxicita Chemistry & Biodiversity, 6, 2138, 2009 3) Proteinové adukty jako biomarkery Int. J. Cancer: 131, 2733, 2012 Adukty vznikající v důsledku expozice tabákovému kouři 3) Proteinové adukty jako biomarkery • hemoglobinové adukty 4-aminobifenylu (4-ABP-Hb) jsou signifikantně zvýšené v červených krvinkách kuřáků – jedná se o vhodný biomarker využívaný ve studiích, kde je nutné odlišit kuřáky vs. nekuřáky – hladina je částečně závislá na antioxidační kapacitě krve; • méně vhodný je 4-hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) hemoglobinový adukt (odvozený od 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanonu (NNK) – nitrosamin specifický pro tabák) – jen marginální zvýšení u kuřáků; • akrylamid a jeho metabolit glycidamid (mutagenní) jsou důsledkem expozice tabákovému kouři i kontaminovaným potravinám, ale bylo prokázáno, že hemoglobinové adukty akrylamidu (AAHb) a glycidamide (GAHb) vznikají zejména v důsledku kouření; • monitoring léčby i vedlejších toxických účinků léčby – příklad – v poslední době se uvažuje o stanovení aduktů acetaminofenu s cysteinem pro monitoring pacientů se selháním jater po předávkování acetaminofenem; 3) Proteinové adukty jako biomarkery DMD 37, 1779, 2009 4) Proteinové adukty produktů lipidní peroxidace • toxické látky indukující zvýšenou produkci ROS mohou významně přispívat k peroxidaci lipidů v buněčných membránách; • reaktivní metabolity v průběhu lipidní peroxidace indukují oxidaci vícenenasycených mastných kyselin v buněčných membránách – tvorba biologicky aktivních reaktivních aldehydů; • tyto elektrofilní sloučeniny mohou snadno tvořit proteinové adukty; je jim věnována zvýšená pozornost především v souvislosti s neurodegenerativními onemocněními, aterosklerózou a v poslední době i v autoimunitních onemocněních; Frontiers in Physiology 4, Art. 242, 2013