Biotransformace I: metabolismus cizorodých látek a regulace hladin biotransformačních enzymů Enzymy metabolismu cizorodých látek Enzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik, steroidních hormonů a mastných kyselin - monooxygenázy (CYP, AKR, FMO), reduktázy (AKR, NQO), hydrolázy (esterázy, epoxidhydrolázy); další reakce: hydratace, izomerace; 2. fáze biotransformace - transferázy (GST, UDPGT, SULF, acetylázy aj.); antioxidační enzymy (SOD, CAT, GPx, GR); 3. fáze biotransformace (ABC transportéry) Biotransformace cizorodých látek, steroidů, eikosanoidů a jiných endogenních látek Compound Phase I (cg. Cytochromes P45t)j Biotransformation by: FTydrolysis Reduction Oxidation Phase II (cg. UDP glucuronosyltransťerase) Conjugation lo large hydrophílic group such as glucuronic acid 1 Metabolite 1 - / / 1 Metabolite 2 Metabolite 3 i Excretion Cleavage HX Detoxification o EaP-7,S-dione DNA addvc ts S tabie and depttrínated DNA actducts DNA addttcts Glycine Ssrine I O-acetyl serine I Cysteine GSH *-Glutamate ^^■N* S-Glurathbne Detoxification Excretion Transcriptomics Responses in Marine Diatom Thalassiosira pseudonana Exposed to the Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Benzo[a]pyrene; Carvalho 2011 Seznam nejvýznamnějších cytochromů P450, které jsou zodpovědné za biotransformaci cizorodých látek: CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 (metabolizují polycyklické aromatické uhlovodíky); • CYP2C9 (metabolizuje nesteroidní antiflogistika a další léčiva), CYP2D6 (beta-blokátory, kodein); CYP2E1 (org. rozpouštědla jako ethanol, benzen, toluen) • CYP3A4 (metabolizuje asi 30% všech xenobiotik, především léčiv včetně antibiotik); • CYP4A11 a další CYPs metabolizující mastné kyseliny (CYP4A = PUFA hydroxylázy; CYP2C a CYP2J = PUFAepoxygenázy) a některá xenobiotika. • Další desítky CYP enzymů jsou zapojeny do biosyntézy a metabolismu endogenních látek, napr. CYP7A (hydroxylace cholesterolu), CYP17 (hydroxylace steroidů), CYP19 (aromatáza - přeměna androgenů na estrogeny). Vlastnosti cytochromů P450 Cytochromy P450 = hemoproteiny; v UV-VIS spektru maximum při 450 nm (v redukovaném stavu a navázaný oxid uhelnatý); výjimka mezi enzymy: široká substrátová specifita, různé katalytické aktivity, výskyt nejvíce v játrech, GIT, plicích, ledvinách, ale i v dalších tkáních). o Klasifikace podle podobnosti sekvencí: genové rodiny CYP1, CYP2, CYP3, CYP4 atd., podrodiny CYP1A, CYP1B atd. (cca 60% shoda sekvence), jednotlivé isoformy CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1; polymorfismus. Conformational Plasticity and Structure/Function Relationships in Cytochromes P450, Pochapsky 2010 I Cyklus cytochromu p450: aktivace kyslíku a monooxygenace Přenos elektronů: NADPH I NADPH:P450 oxido reduktáza cytochrom P450 (substrát RH, produkt ROH, produkce ROS) interakcí se substrátem vzniká vysokospinová forma Fe3+-hemu ©a dochází k přenosu elektronů Fe3+ RH NADPH-P450 reductasered NADPH-P450 reductase ox NADPH-P450 reductase"*1' NADPH-P450 reductase ox STEROIDY: substrátová specifita CYP enzymů monooxygenázové reakce inaktivují steroidní hormony Hydroxylace steroidů v různých pozicích (v závorkách isoformy CYP enzymů) (2C11) 2a-H* 6(3-hydroxylace = specifická reakce CYP3A Testostůrone Estradiol 6B-OH'Testosteiona OH 17-oxo (2C11f 2B1) H-16p (2B1) H-16a (2C11.2B1) METABOLISMUS POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ (PCB) - příklad 1. fáze metabolismu persistentních organických sloučenin Mikrobiální degradace zahrnuje roztržení aromatického jádra Metabolismus %, u vyšších živočichů: oxidativní metab. (hl. cesty A-D, C) Persistentní aromatické sloučeniny: obsahují Cl v sousedních pozicích -bariéra vzniku epoxidu monooxygenázovou reakcí COOH REGULACE EXPRESE: jaderné a cytosolové receptory kontrolují expresi CYP proteinů Foreign Chemical Inducers Hormones, Cytokines Growth Factors expozice ciz. látkami indukuje hladiny CYP enzymů RECEPTORS and TRANSCRIPTION FACTORS Induction CYP GENE EXPRESSION Foreign Chemical Metabolism (P450 ENZYMES) Metabolism of Endogenous Steroids, Fatty Acids. Prostaglandins expozice a indukce CYP enzymů ovlivňuje metabolismus endogenních látek! (společné enzymy CYP pro biotransformaci cizorodých i endogenních látek) NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY Xenobiotika, steroidy a jiné látky steroidy a jiné látky indukují vlastní metabolismus aktivací receptorů/ transkripčních faktorů, které kontrolují expresi biotransformačních enzymů a abc transportérů 1. vazba xenobiotika na receptor (aktivace receptoru) 2. dimerizace receptoru 3. vazba receptoru na specifické responzívní elementy v promotorových oblastech cílových genů A novel panel of mouse models to evaluate the role of human pregnane X receptor and constitutive androstane receptor in drug response, Scheer2008 NUKLEÁRNI A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY nukleární cytosolový receptory receptor receptoru dimerizační partner Seznam CYP enzymů zodpovědných za biosyntézu / metabolismus steroidů a metabolismus xenobiotik CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce dioxiny, PAH; endogenní ligandy?); monooxygenace PAH, estradiolu; CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy, fenobarbitalem, monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj. ♦ CYP2A, CYP2C, CYP2D CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol aj.), monooxygenace etanolu, (w-l)-hydroxylace mastných kyselin CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj. steroidy, monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym biotranformace), 6b-hydroxylace testosteronu CYP4A: exprese regulována PPARa, indukce peroxisomálními proliferátory (Clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), w-hydroxylace mastných kyselin o CYP7A, CYP11 A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: CYTOSOLOVÝ Ah (aryl hydrocarbon) RECEPTOR AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE CYP1A1 SUBSTRÁTEM CYP1A ><11 n i n iii iiiiin IM IM II III AHR changes conformation upon ligand binding HSP90^JAIP ^ARNT Cytoplasmic AHR *W [ complex Nuclear AHR-ARNT AHRR ARNT Ahrr comP|ex complex ^ Cyp1a1 I *Cyp1a2 I Cyp1b1 AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response ■ Inflammation element M Immmune J, response A * /\ Development Ligand metabolism Proteasome-mediated degradation The Aryl Hydrocarbon Receptor: A Mediator and Potential Therapeutic Target for Ocular and Non-Ocular Neurodegenerative Diseases, Choudhary & Malek 2020 LIGANDY / INDUKTORY AhR para 4 í / \ Coplanar NDL-PCB& Non coplanar TCDD = nejsilnější agonista AhR = modelový dioxinový toxikant Gl Cl PCB 15J! Koplanární PCB (podobný dioxinům, agonista AhR) Nekoplanární látky (např. PCB se dvěma chlóry v pozici ortho) nevykazují planární pozici aromatických jader a nejsou agonisty AhR Endogenní agonisté AhR fyziologické funkce AhR - regulovány endogenními agonisty; převážně metabolity tryptofanu; substráty pro CYP1A enzymy - regulace aktivity AhR zpětnou vazbou; o. Kna I UQA 5-HT o Kyn k 1 Inflammation Kyn Neurotransmission/ Kyn & Immune response .derivatives Immune cells pol 5-HTP 4 V TpH2f i Trp X Neurobiologie functions Brain physiology IL-22 production 5-HT receptors^ Gut motility Gut-brain signaling O \Secretion-Absorption Platelet functions : AhR Immune homeostasis Epithelial function Resistance to pathogens Xenobiotics metabolism ubmucosal neuron lj (j v,y Kidney excretion GLP-1 secretion Indoxyl sulfate Agus et al., Cell Host & Microbe 23, 2018 REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: NUKLEÁRNÍ RECEPTORY Nukleární receptory (NR) N-terminal Domain (includes AF-1) -1 r DNA Binding Domain í D BD) «in« Lisand BindineDomain (LBD) 11 n«matn Hinge .. . . _ _, c-term mal Domain * (includes AF-2) B Growth [ _ Factor g ^ Receptor C Cytoplasm j> Steroid p. r* fc> Hormone Nucleus Transcription Factor |> |> Metabolite j> t> Ugand Cytoplasm r^Z] LJ (_J Nucleus J L J LJ C_ Transcription Factor 1 i Homodimer complex o Target-gene transcription Target-gene Iranscription Nucleus RXR 1 ' t_J LJ Heterodimeric nuclear receptor "%J Respon$e element Target-gene transcriptton Flavonoids as dietary regulators of nuclear receptor activity, Avior2013 hi- "L PL \ i ■ h- 1-v s 0 L_.«^Nfl-Ml ■•.v . r. : ■. TU ■l< 1% *ll FfHRA YV.:4rkll A Al, CAB I PPARv 1ŕ.T,iň**n* ^^^^ T l*,r"*>"".*.4»h JF ■ NH2 DNA Ligand COOH Endocrine Receptors Ligands: Hlgh-afflnlty, hormonal lipids E Ra,ß PI R A R G R M R RAR a,ßTy TR o,ß VOR EcR Adopted Orphan Receptors Low-affinity, dietary lipids RXR u,ß,Y PPAR a,rj,7 LXR FXR PXR/SXR CAR Orphan Receptors Unknown SF-1 LRH-1 DAX-1 SHP TLX PNR NGFI-B a,ß,v ROR a,ßty ERR u,ß,v RVRa.fi.Y GCNF TR 2,4 HNF-4 COUP-TFaTp,y NUKLEÁRNI RECEPTORY = „xenosensory" a „lipidní sensory" (aktivace transkripce po expozici xenobiotiky resp. lipidy) Acetyl CoA f CYP26 Retinole Acids Eřftmío Isoprenoids Lanosterol +CYP3A TCVP2B 1CYP27B1 7-Dehydro-Cholesterol 1,25-Díhydroxy-Vitamm O-j t CYP24 ♦ Cholesterol ^XSST ▼ Oxysterols +CYP7A1 Steroids Bile Acids CYP7A1 'CYP8B1 f ABCA1.G1,G5,G8 REGULACE GR / PXR / CAR JM. Pascussi et ai / Biochtmica et Biophysica Acta 1619 (2003) 243-253 NUCLEUS (22 GRE 1 CYP2C9 Více úrovní regulace; aktivace nízkou vs. vysokou koncentrací ligandu -Y- Míl XRE ▼ XRE CYP3A4 CYP2B6 Biotransformace: enzymy 1. fáze enzymy 2. fáze PB r • Cell Growth • Cell Communication • Tumor Promotion • Induction of Genes ot1-Acid Glycoprotein • Glucose Metabolism (NADPHT, UDP*GAt) • Intracellular Redox Potential • Hepatic ER Proliferation • Heme Synthesis and Metabolism In C o o t? c? CC "O o "C o c o U LIGANDY PPARa Farmaka (hypolimidemika) Environmentálni kontaminanty CH3 I O CH2 II I C—O—CH2—CH—CH2—CH2—CH2—CHj C-0-CH2-CH-CH2-CH2-CH2-CH3 CH2 I CH, Di(2-ethylhexyl)ftalát (DEHP) _í Cl o—o N O : Wy 14.643 O // Clofibrate \ 0 Arachidonic Acid Prostaglandin J2 cisS trans 11 conjugated linoleic acid (Endogenní) lipidy DŮSLEDKY AKTIVACE PPARa Liver • FAOfKetogcnesis Lipid storage Lipid storage f Gluconeogenesis A LipogcncsisJ SKM FAO Glucose uptake Glucose utilization Glucose uptake FAO \ Intestine i A SCFAproductionf FAOt Ketogenesist Glucose transport IBS (nit microbiota composition Heart • FAOt Glucose uptakef Glucose uptake WAT De novo lipogenesisf Adipocyte differentiation? A FAOT Lipogenesisf BAT O Dc novo lipogencsis differentiation • FAOÍ Thermogenesist A Thermogenesist FAOT PPARs • PPARa O PPARy A PPARp/o Pancreas ▲ Mitochondrial energy metabolism" Insulin secretionf O Glucose uptakef FAO Brain O Glucose metabolismf PPARs as Nuclear Receptors for Nutrient and Energy Metabolism, Hong 2019 DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE BIOTRASFORMACE A JEJICH REGULACE Další enzymy Lfáze biotrasformace a jejich regulace I flavinmonooxygenázy (FAD enzymy, NADPH přímo reaguje s enzymem); peroxidázy (hemoproteiny oxidující 2-aminofluoren, PAH, fenoly; radikálové jednoelektronové reakce); alkoholdehydrogenázy (koenzym NADH, oxidace prim. a sek. alkoholů); í> aldehyddehydrogenázy (oxidace= detoxikace aldehydů a ketonů); aldoketoreduktázy (AKR, oxidační reakce alkoholů - NAD+; redukce aldehydů a ketonů na alkoholy za účasti NADPH); c> reduktázy xenobiotik (aldoketoreduktázy AKR, dehydrogenázy s krátkým řetězcem SDR, dehydrogenázy se středně dlouhým řetězcem, NADPH/chinonoxidoreduktáza - dvouelektronová redukce chinonů); hydrolázy (štěpení substrátu za účasti vody; acetylcholinesterázy, karboxyesterázy, epoxidhydrolázy) Alkoholdehydrogenázy Metabolismus etanolu třemi enzymovými systémy (alkoholdehydrogenázy + aldehyddehydrogenázy, CYP2E1 a katalázou) H20; H20 02+ NADPH NADP- + H-.0 AI d o keto r ed u ktázy í> většinou monomerické NAD(P)(H)-dependentní oxido- reduktázy; konvertují karbonyl; o dosud 115 enzymů ve 14 „genových rodinách"; o substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní hormony; prostaglandiny a lipidové aldehydy; metabolizují také některé chemické karcinogény (NNK, PAH-trans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd) Příklady lidských AKR: í> AKR1A1 (aldehydreduktáza) > AKR1B1 (aldosareduktáza) e> AKR1C1-1C4 (20a-, 3a-5 3a/17a-5 3a-HSD) o> AKR1D1 (5b-reduktáza) 1. fáze biotransformace PAH: účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenace), EH (hydroláza) a AKR (reduktáza) Ct2? CYP-Pfroxiílnsr CVPlAlrCYPlBl Epoxide Hydrolase Detoxikade ŕ versus 1 bioaktivade OH i-nir-?.a-i'iioi C V Pí A1 no* OH Na IX-ľ NAfJ

K oS9- Dep urin m ti n g Una Adciuci. KtuľcuJ Clil ion HO on '. li katecholy = - metabolity PAHs, - podobně metabolity steroidů (E2) O' ii-vniíquinorK anion radical KS I OKitlfttlvc DNAJ V Dinner # BP-7,8-Dione Aldoketoreduktázy \ K K I A AKR1B1 AK1CI-AKR1CJ Biotransformace aldehydů vznikajících v průběhu lipidní peroxidace A k K I H I ,OH H' H 1,4-DihydrůKy-2-rioncne Detoxikace NNK (4-(methylnitrosamino)-1 -(3-pyridyl)-1-butanon) (tobacco smote) ]jJ=Q Carbcmjl Jíeduclion N"CHj lip-HSPTypíl AXRICl" AKRIC2 AKRIC4 CYP2A6/3A4 (Q-hydťOijrUiiůrtl NNAL-fclucurůnidc Excretion Regulace aldoketoreduktáz Transkripční faktor Nrf2 je regulován oxidativním stresem / elektrofilními metabolity a také aktivací A h R Cytoplasm 1. Keap1/Nrf2 regulatory kinases and the effect on ARE-dependent gene expression A. MAPK: ERK (activation), JNK (activation) and p38 MAPK (activation or suppression) B. PI3K/Akt (activation) C. PERK (activation) D. PKC (activation, directly phosphorylates Nrf2 at Ser40) E. Fyn (suppression, directly phosphorylates Nrf2 atTyr568) 2. Keap1/Nrf2 regulatory proteins: A. ATF4: forms a heterodimer with Nrf2 and activates ARE. B. DJ-1/PARK7: stabilizes Nrf2 by preventing association with Keapl. C. Bachl: occupies enhancer region of HO-1 and suppresses Nrf2 binding to ARE. D. p62: interacts with Nrf2 and stabilize Nrf2. Keum, Biomol Ther, 2012 Bifunkční a monofunkční induktory BifurLťLiumil inducer MomifunctmiuiL inducer ]■■ nu TÍADS Bifunkční induktory = xenobiotika aktivující AhR a Nrf2 NQO; GST a další enzymy 2. fáze biotransformace XKb CYPIA Maf) GST/NQO ARE XRE = xenobiotic (dioxin) respons element; ARE = antioxidant response element Miao et al., Biochem. Pharmacol., 2004 Esterázy Esterázy = hydrolázy, enzymy katalyzující hydrolýzu esterů; mezi nejvýznamnější patří např. acetylcholinesterázy, fosfatázy aj. c> Acetylcholinesteráza - degradace neurotransmiteru acetylcholinu za vzniku cholinu a acetátu; hydrolyzuje také řadu insekticidů, herbicidů a bojových chemických látek, zároveň je jimi inhibována). HO-ŕ' ^NO '2 p-nltrofenol para, h icr Epoxidhydrolázy Funkce: o - metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách o metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou Celkem 7 forem EH: o savčí solubilní (cytosolová) EH - inaktivace epoxy-mastných kyselin c> mikrosomální EH - inaktivace BaP-dihydrodiolepoxidu leukotrien A4 hydroláza etc. o> regulace např. aktivací Nrf-2