ToxCast &EPA A Tox2/ * ★ * EU * * ★ *** íM ToxBank Moderní metody v toxikologii a jejich aplikace (24.4.23) J. Procházková Aspekty toxikologie Toxicita látek a stanovení mechanismu účinku vč. rizik environmentálni polutanty In silico aditiva kontaminanty potravin • AOP koncept • bio/monitoring • prevence průmyslové chemikálie léčiva In vivo pesticidy AOP koncept Predictiuity of measurement for AO decreases Time between exposure and effect increases Toxicity Pathways Regulatory f Apical) Endpoints AO RĚCeptor/Ltgarid Inteíaciioíi DMA Binding Protein Oxidation Protein Praducliors Altered Signaling Altered Physiology Disrupted Homeostasis Aiteied Function impaired Development Impaired Reproduction Stfuclure Recruitment Extinction High Throughput Screening Assays Ecological Studies;Epidemiological Studies Mechanistic {Eco)Toxieology Clinical Dáta Molecular Epidemiology a. ST CL CD EU c a> • princip zhromažďovaní informací vedoucí k propojení znalostí, které popisují mechanismus účinku určité chemické látky s praktickým stanovením rizika a nastavením regulačních norem Carusi, 2018, Sci Total Env In silico toxikologie / machine learning Raies, 2016 Methods for generating the models - predikce a modelování na základě struktury látky - srovnávání s databázemi látek, kde je znám vztah struktura-toxicita In vivo vs In vitro komplexní tkáňové prostředí organismu úroveň metabolismu odpovídá reálné situaci efektivní určení poměru dávka vs. efekt testování směsí na orgánové a organizmální úrovni • možnosti qHTS provedení • odhalení nových látek • snaha nahradit in vivo testy in vitro testováním • snazší reproducibilita speciální požadavky a zázemí pro chov dedikovaný personál časová a finanční náročnost otázka etiky • cena • přístrojové zázemí • chybí orgánový a komplexní kontext In vivo toxikologie př. zebrafish výhody Zebrafish modelu monitoring přítomnosti toxických látek odhalení mechanismu účinku testování vlivu urč. genu či signální dráhy na toxicitu vyvolanou testovanou látkou tkáňové prostředí Neurotoxicity Response element Reporter gene Contaminants HI RFPGFP zebrafish zygote No contaminants 1 Dai, 2013 Cassar, 2020 In vivo toxikologie př. zebrafish Arsenic B PA TCDD Embryo Larvae/juvenile Cardiovascular defects, apoptosis >H yperactivity Adult Gene expression, metabolomtc change^ fatty I Ever ■ Fl Reduced ^ biomass at 3 months Skeletal and cardiovascular defects Decreased DNA methyiation in gonad, blocked ovulation, reproductive defects y Skeletal defects, wptp( reproductive defects J Increased ^rate of heart failure NPoor embryo quality Bambino, 2017 (Z In vivo toxikologie př. zebrafish př. testovaných parametrů - FET - fish embryo acute toxicity test Table 1. Apical observations of acute toxicity in zebra fish embryos 24 - 96 hrs post fertilisation. Exposure times 24 hrs 48 hrs 72 hrs 96 hrs Coagulated embryos + + + + . Lack of somite format ion - -i- + + . Non-detachment of the tail - + ... . Lack of heartbeat + + Hl>. 2: Lack uf somite Formatton: Although retarded in development by appro*. 10 hrs. the 24 hrs old zebraftiih. embryu in U) shows Wclt-dtvclůped Somites (—whereas the embryu eiI (\>) Joes ílúl shůW any sign of somite formůticri (—Although showing a pronounced yolk sac oedema (*), the 18 his old zcbralish embryo m (t) shows distinct formation of samites. <—•■), whereas, the 9fi hes. oEd zcbraíisň embryo depieted in [a] docs not show any sign of somite formation (—»). Kule aJso the spina] curvature (seottctsti) iind the pericardial oedema (*) Ln die embryo shown ut fa}. Test No. 236 - OECD In vivo toxikologie př. zebrafish př. testovaných parametrů hepatotoxicita acenaftenu Survival rate 24hLC50=23.15mg/L 48h 1X50=18.32 mg/L 72h LC50=12.60 mg/L aktivita jaterních enzymů AU ŕ y č % Fertilized chicken eggs are rinsed using distilled, a vi toe laved water and stored horizontally in an incubator at ~38iC On dav three 6 ml of albumen are removed with a surgical syringe and the punctuation side is covered with an adhesive strip. Two adhesive strips are then affixed on the upper side of (he eggshell to improve stability and durability of the eggshell before incision, Subsequently the eggshell is partially opened with --Eerili/ed scissors allowing exposure of the developing CAM. the opening is then covered with Parafilm© to avoid evaporation and infection. [ We performed intravascular injection starting from, day 8 of embryonal development. Other working groups haw described experimental protocols with intravascular injection as soon as day 3. We used a 30G Needle to punctuate a specific vessel on the CAM. 1 »L*r 1 '- The injection side was subsequently coagulated using silver nitrate pens to avoid excessive bleeding. If particles are fluorophore-labeled particles in vivo microscopy can bo performed at different time points after intravascular application, allowing quantification and tracking of naroparticles in t he bloods! rea m. For isolation of CAM tissue the egg is broken over a pelri dish. Subsetjuenlly the CAM is loaded onto a spatula, excised, and transferred to a second petri dish filled with water. Histological dimples tire then transferred into embedding cassettes and stored in 4% formalin. Organs are isolated by surgical dissection and also stored in embedding cassettes, For preservation, the cassettes are stored in 4% formalin. - Widely used fw drugs and chemicais ■ La^ge. arrvaunt of h-is-tc=ri-"3l control data ■ Larger group size vs rabbit or H HP ■ Limited intramuscular injection volume23 ■ limits blood ss npi ing. may necessitate sate Irte groups fcr add: ti anal samplirj.'' measurement - Human-jnmal bodywtratio higjierthan rabbit - Often used for iran-clinical immunology ■ Large amount of ti i[tcrical control [lata ■ Larger group size vs rabbit or N HP ■ Lmiteri intramuscular injectinn volume23 - Lmited blncd sampling may necessitate satellite groups for additional samplmg ■ Small rodent ■ May not be possible to measure all end-pcints in each animal - Humanansmal body ivt ratio higher than rabbit - Large non rodent - SdKcientbJQodsamplmgvdurne ■ Fii II intram-j scular injection rafuiie^ ■ All for most] &nd^: nts ran be measured iir each annual - Humamanimal body *t ratio lower than rodent - Deficate husbandry ■ Lmited historical control data fbt some study types - No urinalysis or DV ■ Smaller group sine vsrodenb ■ Limited jnt^rnuscidarinjeclian. mlunre^ - Limited Hood sampling, may necessitate satellite groups for additional sampling - Small rodent - Lmited number small group sizes ratents or raifcits ■ Expensive ■ ::n ;a is^e: Osnova Moderní metody v toxikologii In silico Replacement Reduction Refinement Ex/I n vivo Occupational Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii Higher specificity Loss of realism Universality Confounding factors Phenotype Fig. 1 A simple overview of gene expression in eukaryotes and its relation with omics methods and their analytical targets. Not all mechanisms intervening in the regulation of gene expression are represented (such as interference RNAs), as well as post-translational modifications (like phosphorylation and glycosylation) and eventual degradation of proteins by proteases and the proteasome. However, all these factors have important consequences for omics measurements. Madeira, 2021 Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii 1. Genomika 2. Transkriptomika př. RNAseq, GROseq, ATACseq 3. Proteomika př. Hmotnostní spektrometrie (MS) 4. Metabolomika př. HPLC-MS/MS 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy qHTS assays Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii 1. Genomika 2. Transkriptomika př. RNAseq, GROseq, ATACseq 3. Proteomika 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy Transkriptomika RNAseq - globální analýza transktriptomu AAA AAA AAA AAA AAA AAA Select RNA fraction of interest (poly(A), ribo-minus and others) AAA AAA AAA AAA AAA AAA Fragment and reverse transcribe Sequence, map onto genome Quantitate (relative, absolute, nonmolar and others) 3x 2x 1x Transkriptomika GRO-seq - globální analýza aktivní transkripce GLOBAL RUN-ON SEQUENCING (GRO-SEQ) Run on with analog Isolate and Hydrolyze Bead coaled with o-BrduTP Elute Revwse cDNA antibody Cap removal Transcription End Repair Amplification A. Active RNA Polymerase Is allowed to run on in the presence of Br-UTR. B, RNAs are hydrolyied and purified using beads coated with Brd-UTP antibody. C The eluted RNA undergoes cap removal and end repair prior to reverse transcription to cDNA. D. cDNA is sequenced. Transkriptomika ATAC-seq - globální analýza přístupnosti chromatinu Closed chromatin Open chromatin Tn5 transposome Amplify and sequence Transkriptomika • kombinací těchto metod lze získat informaci o změně profilu genové transkripce indukované testovanou látkou • následné analýzy pomocí „free" či placených nástrojů mohou naznačit biologický proces, dráhu či signalizační spouštěč (př. GSEA, IPA) • identifikace genových podpisů spec. pro urč. skupinu látek • nominace cílových genů pro vytvoření reportérového systému • výhody - globální měřítko, rychlá a relativně nenáročná příprava vzorku • nevýhody - cena, nutnost bioinformatického zázemí pro následné zpracování dat a s tím se pojící nutnost výpočetní kapacity • nutnost verifikace dat dalšími metodami - RT-qPCR, WB atp. Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika př. Hmotnostní spektrometrie (MS) 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy Proteomika „ Top-Down" proteomika - analýza intaktních proteinů - identifikace proteinových izoforem - mapování proteinových modifikací "Bottom-Up" proteomika - štěpení proteinů na peptidy, separace - nejčastěji používaný přístup cílová analýza - ESI/LC-MS/MS Proteomika A) Proteoforms B) Bottom-up Approach Tryptic digest Peptides I Electrospray ionization 2 -1 Peptide Ions c) Top-down Approach Electrospray ionization ■2_i frjfsrf precursor fön ^ Fragmentation 2_1 Fragment ions TOP-DOWN ln-gel separation (i.e., 2DE, GELFrEE) Proteome extraction Cell or tissue 4> #• % Proteoforms ln-gel separation (SDS-PA6E) BOTTOM-UP ■* Digestion Protein or peptide MS Data analysis PROTEOFORM IDENTIFICATIONS Protein ID Quantitation PTM Mapping Data analysis 2D LC Peptide MS CANONICAL PROTEIN IDENTIFICATIONS (including amino acid variants) Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika př. HPLC-MS/MS 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy Metabolomika impact the metabotype Mathematical modeling and pathway analysis Diagnostic biomarkers Mechanistic insights • informuje o vlivu expozice na biochemické úrovni a poskytuje biomarkery spojené s aktuálním stavem expozice jedince, jeho zdravotním stavem atp. • buněčné a tkáňové zdroje -moč, sliny, sérum... • koncept „exposome" = „kumulativní analýza environmentálních vlivů, stravy, chování atp. na biologické procesy v průběhu života jedince" Early detection for early intervention Disease diagnosis and treatment monitoring Identification of exposure reduction prioritization Target identification for drug or nutritional interventions Molecular and Biochemical Toxicology, 5th edition Ukázka propojení „omic" metod Environment International 157 (2021) 106802 ELSEVIER Contents lists available at ScienceDirect Environment International journal homepage: www.elsevier.com/locate/envint Integrated multi-omics analysis reveals the underlying molecular mechanism for developmental neurotoxicity of perfluorooctanesulfonic acid in zebrafish ■ Hyojin Lee rt, Eun Ji Sungb, Seungwoo Seo } Eun Ki Min ', Ji-Young Lee !, Ilseob Shim üt Pilje KimLl, Tae-Young Kim ,JlJ, Sangkyu Lee^'3'2, Ki-Tae Kirn8** 1 Department of Environmental Engineering, Seoul National University of Science and Technology, Seoul 01811. Republic of Korea h 8K21 FOUR Community-Based Intelligent Novel Drug Discovery Education Unit, Collage of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republic of Korea r Schoo! of Earth Sciences and Environmental Engineering, Gwangju institute of Science and Technology, Gwangju 61005. Republic of Korea d Environmental Health Research Department, National Institute of Environmental Research, Inchecn 22689, Republic of Korea • PFOS - transkriptom, proteom, metabolom - indukce vývojové neurotoxicity - deregulace oxidativního stresu a energetického metabolismu - indukce zánětu, deregulace Ca2+ signalizace, deformace axonů Lee, 2021 Ukázka propojení „omic" metod ELSEVIER Contents lists available at ScienceDirect Science of the Total Environment journal homepage: www.elsevier.com/locate/scitotenv Metabolomics and proteomics study reveals the effects of benzo[a]pyrene on the viability and migration of KYSE-150 esophageal cells Yuting Sheri;, Guangshan Xie, Siyi Lin, Lin Zhu, Hongna Zhang, Zhu Yang *, Zongwei Cai Staffi Key Laboratory ofEnvironmental and Biolagkal Analysis, Department of Chemistry, Hong Kong Baptist University, Hons Kong, China • kombinací metod lze získat informaci o změně profilu genové transkripce indukované testovanou látkou a zároveň identifikovat biomarkery expozice v příslušné tkáni Ukázka propojení „omic" metod Shen,2022 Data analysis Cell culture Protein extraction Digestion & labeling LC-MS/MS Fig. 1. Schematic workflow of the integrated metabolomics and proteomics study approach applied in the present study. * B [a]P caused reduced cell viability and increased oxidative stress in esophageal cells. * In response to B[rz]P treatment of cells, TXN was upregulated and GSH depleted. * B[n]P induced the expression of both tumor suppressor and promoter proteins, such as Si00 family, AXN, Basigin and Serpin B5. * B[a]P not only inhibits cell proliferation but also impairs the cell mobility of the esophageal epithelial cells. GSH conjugates, GSSH H20 Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii i_i 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy qHTS assays - štandartní testy cytotoxicity a proliferace - aktivita NADPH oxidáz (př. MTT test) - spotřeba ATP (př. Cell TiterGlo) - poškození membrány (př. LDH assay) - produkce aminů (př. Live/Dead fixable dead cell stain) - množství DNA(př. CyQuant) Osnova Moderní in vitro metody v toxikologii i_i 1. Genomika 2. Transkriptomika 3. Proteomika 4. Metabolomika 5. Kvantitativní vysokokapacitní analýzy qHTS assays - specifické testy - kvantitativní monitoring buněčné morfologie pomocí impedance - reportéry enzymatické aktivity - reportéry transkripční aktivity (př. Attagene Transfactorial, CALUX) - disrupce mezibuněčné komunikace (př. GJIC, TEER) - detekce disrupce syntézy a metabolismu hormonů Monitorování buněčné impedance *>f \ ACEA Biosciences. Inc. 0 stanovení vlivu testované látky na základní buněčné parametry vč. cytotoxicity (no cell) _^ tttttttttm electrode • cell i electrode cells electrode electrode without cell m » ttt electrode attached with 1 cell electrode attached with 2 cells ® Z = Zfl baseline impedance <3> ® Z = Z cein L impedance increased ® z = z, cell 2 impedance doubly increased > Analýza růstu, proliferace, adheze Solly, 2004 Monitorování buněčné impedance Research A Section 508-conformant HTML version of this article is available at https://doi.org/1D.1289/EHP7102. Aggressiveness and Metastatic Potential of Breast Cancer Cells Co-Cultured with Preadipocytes and Exposed to an Environmental Pollutant Dioxin: An in Vitro and in Vivo Zebrafish Study Meriem Koual,',2J,t Celine Tomkiewicz,1* Ida Chiara Guerrero,4 David Sherr/ Robert Barouki,'f and Xavier Coumoul1'3' "UMR-51 124. Institut national de la saiité ct dc la recherche medicale (Inserm), T3S, Toxicologic Envirojinementale, Cibles Lherapeutiqu.es. Signalisation cellulairr a Biomarquems. Paris. France "Service de Chirurgie Caneérologique Gyněcologique et du Sein, Hůpital Europeen Georges-Pompidou, Assistance Publique-Hopitaux de Paris, France ^Universitě de Paris. Paris. France 4Plateťorme proteomique 3P5-Necker, Structure Federative de Recherche Necker, Universitě de Paris, US24/CNRS UMS3633, Inserm, Paris, France 1 Department of Environmental Health, Boston Universily School of Public Health, Boston. Massachusetts, USA příklad in vitro vs. in vivo přínosu Monitorování buněčné impedance □AY 1- MCF7 cells or MDA-MB231 are cultivated in 6-well plate, co-expo3ed or not ta hMADS cells during 24 hours. insert 0.4 |-dioxin. Koual, 2021 Monitorování buněčné impedance vs. in vivo test šíření metastáz MC F 7 MDA-MB-231 LJ s ■ CIJ Nr. rnfnaaucht T i*-^—,— V. — 1 J-s ■š i U ^.: I Ti li Figure 6. Measurement of metastatic spread of MCF7 and MDA-MB231 cells in zebralish larva.? in vivo models Human RFP-MCF7 (left) or RFP-MDA-MB-231 (right) cells cultured with conditioned media from different conditions, were injected into the penvitellme space of 2-da.y-old zebralish larvae [Control (vehicle MCF-7 cells, alone). TCDD (MCF-7 cells treated with 25 nM TCDD), co-culture (MCF-7 co-cultured with hMADS), and coexposure (co-culture with TCDD)]. Fish were imaged 24 h later al S.5 X magnification by fluorescence microscopy. (A) Representative images from 2l^f6 fish/group. (B) Quantitation Of (a) the number of fish with one or more metastases and (b) the average number of metastases/fish+SE. Graph represents means ±SEM of three measurements. The numerical information mean + SEM and p-values are provided in Table 5&. (Kruskal-Wallis's H test (nonparametrie comparison of k independent series) followed by a l-factor ANOVA test (parametric comparison of A: independent series. * p< 0.05). (C) The percentage of fish with metastasis in the head region. Each experiment was repeated in triplicate (MCF-7) or quadruplicate (MDA-MB-231) with 7-J2 fish per condition in each experiment. Note: ANOVA. analysis of variance; SEM, standard error of the mean; TCDD, 2.3,7,8-tetraehlorodibenzo-p-dioxin. efekt dioxinu na formaci metastáz Koual, 2021 Mikroelektrodové arrays AXION BIOSYSTEMS Imagine * Explore • Discover o síť elektrod monitorující elektrický odpor vytvářený buňkami o měří elektrickou aktivitu buněk ® AXION Mean Firing Rate = * of Spikes / Time Burst of Action Potentials c HI 41 Activity Oscillotion Connectivity 6 o 4 Synchrony Axion Biosystems Příklad testování neurotoxicity AXION BIOSYSTEMS Imagine * Explore • Discover MEA preparation • 384 ToxCast compounds (222 active in single-concentration screen) were screened in a concentration range (7 concentrations. 0.03-40uM) * Compounds were analyzed in 43 parameters (including MFR) 1. Primary cortical neurons are cultured id 48-well MEA plates for 13 day3 2. Plates are placed in the Axion Maestro MEA amplifier 3. Determine parameter activity in each well for 401 prior to and after treatment with compounds 1. Characterize chemical potency and assess multiple parameters 2. Develop a method to distinguish between neuroactive and non-neuroactive compounds 3. Determine what could be driving different neuroactivity patterns Axion Biosystems TEER analýza o „Transepithelial electrical resistance" 0> měření permeability buněčných membrán skrze měření elektrického odporu o test disrupce mezibuněčných spojení o monitoring permeability buněčných bariér o informace o kompaktnosti buněčné vrstvy a mezibuněčných těsných spojů c> př. tkáňová toxicita - Gl, plíce, BBB ... TEER measurement with chopstick electrodes. The total electrical resistance includes the ohmic resistance of the cell layer Ry^R. cei' eulture medium RM, the semipermeable membrane insert R[ and the electrode medium interface R^mi- Srinivasan, 2015 (Z assay - příklad Shaughnessey, 2022 a HHHHHHHHKHHH HHHHKHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHH H-'HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH - —_mi____.. Kvantifikace obrazové informace TJs _5 |JM__15 |jM__25 \M Untreated Vehicle o Flow #1 Top Channel , Membrane Flow #2 Bottom Channel pnmarni vaskulární endotelie ledvinové proximální T epiteliální z buňky | Co-culture, low FSS Mono-culture, low FSS Co-culture, high FSS Mono-culture, high FSS Untreated Vehicle 5 uM Dose 15 uM 25 uM o nefrotoxicita cisplatiny - 96-well formát - 2 formáty mikrofluidity assay - příklad a HHHHHHHHKHHH HHHHKHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHH H-'HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH HHHHHHHHKHHH Flow #1 Top Channel , Membrane Flow #2 Bottom Channel | _z Shaughnessey, 2022 TEER - Kvantifikace prostupnosti bariéry epitel-endotel csPt t = 24 hr t = 48 hr t = 72 hr o _L o Untreated Vehicle 5 ljM 15 uM 25 m M Untreated Vehicle 5 mM 15 mM 25 mM Untreated Vehicle 5 hM 15 mM 25 n M o nefrotoxicita cisplatiny - 96-well formát - 2 formáty mikrofluidity Stanovení transkripční aktivity jaderných receptoru (NR) o Attagene FACTORIAL™ assay o odhalení módu agonista, antagonista o cis^ a trans- mód AUagene CsA«ay (Example: PPRE) jL'heiiiicnl (®i i—^-líepnrUT Ři_ Upal :i .-Mi. Attagene Trans Assay {Example: PPAR?) iJľrKrtúcal -^Reporter ^ ^Wiatg ATTAGENE Reporter Assays ' I ŕiinícri r»[i(?ri a f Reporter 1 I ipiil s.tl>: Mako clJNA, add adapter Lata! Adapter and cul vviili I Ipal QlWIIlilBlC 1 -í H ĽJK'11 l-i ti • Kl'5< 'ili-i ( 4£ ma l> Capillar) Kkctroplmrcsis Multiple repoter transcription unit (MRTU) + chimeric Gal4-NR protein > až 48 typů lidských jaderných receptoru Testování transaktivace NRs - CALUX 0 DR, AR, PR o detekce reportéru tj. aktivita luciferázy Recombinant cell Dioxins Furans From contaminated sites AhR complex DRE př. DR-CALUX + vší* J CYP1A1 Nucleus ARNT ,í\. DRE Lucifera Cytoplasm m RNA -O- Increased cytochrome P4501A-1 Luciferase activity' and other proteins J/ y Sakthivel, 2016 Testování transaktivace - DR CALUX ® (Z o př. skríning PCBs a dioxinových látek v rybách o může DR CALUX „nahradit" štandartní GC/MS? C> stabilní linie-H4IIE, HepG2 Mül. Nu Ii. Food Res. 2006, Sů, 945-957 DOI 1Ů.1002Ann[r.200600001 The use of the DR CALUX bioassay and indicator polych lorinated biphenyls for screening of elevated levels of dioxins and dioxin-like polychlorinated biphenyls in eel Ron Hoogenboom', Toine Bovee', Win Traag1, Ronald Hoogerbrugge*, Bert Bau mann2, Liza Partier1, Guido van de Weg1 and Jaap de Vries3 1 RIK.L1.I, institute oT loud Saicly, Wagciungcn, I lie Netherlands - RIVM, Hülhoven, The Netherlands ! VWA, Zulphen. The Netherlands 70 ....... ♦ y =0.028x + 9.360 R2 = 0 91 500 1000 1500 2000 indicator PCBs (ng/geel) c> GC/MS- limitace- malé množství vstupního vzorku, cena, náročnost analýzy TEQs- toxic equivalence concentration + TEFs TEFs - toxicity equivalency factors Hoogenboom, 2006 Testování znečištění ovzduší Development and Application of a Novel Bioassay System for Dioxin Determination and Aryl Hydrocarbon Receptor Activation Evaluation in Ambient-Air Samples Songyan Zhang,'1' Shuaizhang Li,1'"1"'" Zhiguang Zhou,^'" Hualing Fu/'^ Li Xu^'* Heidi Qunhui Xie,*'^ and Bin Zhao*'t4© State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China +University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China ^State Environmental Protection Key Laboratory of Dioxin Pollution Control, National Research Center for Environmental Analysis and Measurement, Beijing 100029, China Zhang, 2018 Testování znečištění ovzduší Zhang, 2018 CBG2.8D MDL: 0.1 pM ■3 r Ambient-Air Í PCDDs i • ■ j PCDF í «- ti 0 Hs? i ! DL-PCBs j .00 J ! Others Dioxin Determinations Totaf AhR Activation (TAA) * sensitivní metoda pro detekci aktivace AhR a stanovení rizik pro látky vyskytující se v ovzduší (Polycyklické aromatické uhlovodíky -PAHs) 0.6 1 £ 04-1 Se IB q m t! u □ PAHs I DL-PCBs 80 u c O O Ü LÜ in 60 40 ■ S 20 i y = 110.50k + 38 98 Rŕ = 0.90 0,1 0.3 14 Relative Toxicity Equivalents of the PAHs [pg TEQ m ') n d y) 4 n o — m é 3 jš 2 U CD 00 -— m o 2 - y = 5.81X + 0.12 R2 = 0.97 V • oc 0.2 0.4 0.6 HRGC-HRMS (pg l-TEQ m ') 0 3 Analýza vazby ligand-receptor o NovaScreen NR HTS Ligand-Binding Assay c> cell-free formát > kompetitivní assay - př. radioaktivní estradiol vs. testovaná látka, vazba na ERalpha 0 AR, ER, PXR, FXR, PPARa, PPARg, TRa Wash buffer "M It*, Filter 4 Wash buffer ■h Unbound Iŕgand Testování enzymatické aktivity - DI01 ThyrokJ G) & Iodine Inflammation Selenium Cytokines Iron EDC Drugs V / 4 atomy I ve strukture ^^ov t h production 80% T, 20% Tj' DI01É DI02 Activaiion í í Periphery TH Inflammation Selenium Cytokines Carbohydrate diet EDC Drugs © D101.D102 Activation TV 0101 D103 TH Inactivation (rT3.3.3-T2...) Legend: Inhibition/ Inactivation Activation/ Stimulation / \ DIOI & DI03 : DI03 EDC : Hypoxia Drugs High Inflammation: proliferation EDC Drugs 3 atomy I ve struktuře + volný atom I Growth Metabolism Oi consumption Body temperature rain development * Inhibice aktivity chemickými látkami -cell-free assay ■> Inkubace enzymu s testovanými látkami 3h o Pokud dochází k inhibici aktivity klesá nárůst volného jódu, který se následně stanovuje C> 96-well formát, HEK293 DI01-OE Köhrle, 2022 Analýza disrupce syntézy steroidních hormonů *» CeeTox H295R steroidogenesis assays o stanovení vlivu testované látky na syntézu steroidních hormonů í> odhalení endokrinních disruptorů 0> 96-well format o Detekce 13 steroidních hormonů pomocí LC-MS/MS CeeTox H295R steroidogenesis assays MTC Evaluation Plate Cells (overnight) r A 10 uM FSK (48 hrs) v A Chemical (48 hrs) H295R cells pre-treatment: 100 u.M seeded to stimulate chemical ~50% steroidogenesis treatment confluency Concentration-Response w Plate Cells ^ 10 jiM FSK L Chemical A ^ (overnight) . W (48 hrs) Á ^ (48 hrs) A H295R cells pre-treatment: 6 cone. seeded to stimulate chemical ~50% steroidogenesis treatment MTT Cytotox > Media to OpAns Cell viability >70% else: lOx dilution HPLC-MS/MS quantification of 13 hormones Cell viability HPLC-MS/MS quantification of 13 hormones confluency Osnova konzorcia a databáze 1. ToxCast 2. Tox21 3. ToxRefDB 4. ToxBank 5. TOXRIC 6. ToxNET 7. Zajímavý literární zdroj TOXICITY FORECASTER (TOXCAST) IN VITRO ASSAYS Assay Documentation for Non-Guideline In Vitro Test Methods February 22, 2022 ToxCast o In vitro qHTS výstupy ("high-throughput screening") předpovídající toxicitu testovaných látek 0 EPA - -700 HTS využívá vysokokapacitní metody a výpočetní počítačové modely pro vytvoření předpovědi toxické aktivity určité látky a stanovení rizika í> 1800 chemických sloučenin - různé zdroje o farmaceutický, chemický, kosmetický průmysl, environmentálni zdroje, bezpečnost potravin ToxCast HTS Assays: >1100 readouts / effects Assay Provider ACE A Apredica Attagene BioSeek Cell? Direct NCGC/Tox21 NHEERL MESC NHEERL NeuroTox NHEERL Zebrafish NovaScreen Odyssey Thera Readout Type Single Multiplexed Multiparametric _j f Cell Format Cell free Ce!l lines Primary cells Complex cultures ^Free-living embryos^ Biological Response cell proliferation and death cell differentiation mitochondrial depolarization protein stabilization oxidative phosphorylation reporter gene activation gene expression (qNPA) receptor activity receptor binding /^Target Family^ Response Element Transporter Cytokines Kinases Nuclear Receptor CYP450 / ADME Cholinesterase Phosphatases Proteases XME metabolism GPCRs \^ Ion Channels _^ r Assay Design viability reporter morphology reporter conformation reporter enzyme reporter membrane potential reporter binding reporter \^ inducible reporter ^ ( Species Tissue Source Human Lung Breast Rat Liver Vascular Mouse Skin Kidney Zebrafish Cervix Testis Sheep Uterus Brain Boar Intestinal Spleen Rabbit Bladder Ovary Cattle Pancreas Prostate Guinea pig ^Inflammatory Bone^ ^ Detection Technology ^ qNPAand ELISA Fluorescence & Luminescence Alamar Blue Reduction Arrasyscan / Microscopy Reporter gene activation Spectrophotometry Radioactivity HPLCand HPEC TR-FRET R. Judson, EPA, 2012 (Z Tox21 Attene-Ramos, 2013 í> In vitro toxikologie 21. století (est. 2008) robotizace, 1536-well format o ~80 assays o Cíle: Thomas, 2018 Assay group review Assays A fox?/ \ Public database Data sharing A/CGC Assay optimization Validation Robotic validation Miniaturization qHTS 1%J Data processing Drug Discovery Today 1 identifikovat mechanismus biologické aktivity testovaných látek určit látky pro další extenzivní testování vývoj modelů pro predikci in vivo odpovědi vývoj strategických a operačních plánů National Center for Advancing Translational Sciences T0X21 GATEWAY LÜG IM Applications' Resources * Contact Us Toxicology in the 21 st Centu Through a Memorandum of Understanding, research, develop, validate and translate innovative c testing methods that characterize toxicity pathways Research, develop, validate and translate innovative chemical testing methods that characterize toxicity pathways. zakladatelské organizace: Environmental Protection Agency (EPA), National Toxicology Program (NTP), National Institute of Environmental Health Sciences, National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) and Food and Drug Administration (FDA) § iox2l Public Data 0£ I ox2l Assay Tracking U I'úx2l Dala Browser Q lox2l Dala Download in Pathway Browser Q Collaborator Download S íox2l Manuscripts A Tox2l Assays S f ox21 Publications O I ox21 Presentations IV lox21 Curve Browser /■ SAR Tools