Typy genetických markerů Single locus Codominant PCR assay Overall variability Nuclear multilocus Minisatellite DNA fingerprints No No No High RAPD No No Yes High AFLP No No Yes High Nuclear single locus Alozymy Yes Yes No Low-medium Mikrosatelity Yes Yes Yes High SINE (LINE) Yes Yes Yes Low SNPs Yes Yes Yes Low-high Multi-locus genetic markers •Mnoho znaků náhodně rozmístěných v genomu – celogenomový scan Øminisatellite DNA fingerprinting ØRAPD (randomly amplified polymorphic DNA) ØAFLP (amplified fragment length polymorphism) •presence vs. absence restrikčního místa (AFLP) či místa pro dosednutí primerů (RAPD) = dominantní znaky (neodliší heterozygota – proužek na gelu buď je nebo není) •není nutno znát předem genom studovaného druhu (tj. primery či sondy) • Př.: chromozóm 1 Každý jedinec má jedinečný genom GTAGAATTCATTCACGCA CATCTTAAGTAAGTGCGT Záměna v restrikčním místě = zde ke štěpení nedojde GTAGAATgCATTCACGCA CATCTTAcGTAAGTGCGT 1. Ztráta nebo nabytí restrikčního místa Enzyme Site Recognition • Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site • Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC) Palindrome Restriction site Fragment 1 Fragment 2 Common Restriction Enzymes EcoRI – Eschericha coli – 5 prime overhang Pstl – Providencia stuartii – 3 prime overhang Každý jedinec má jedinečný genom 2. Ztráta nebo nabytí SINE (např. Alu sekvence) nebo LINE Každý jedinec má jedinečný genom 3. Vysoká mutační rychlost minisatelitů a mikrosatelitů – rozdíly v počtu repeticí, tj. v délce daného úseku Repetitivní DNA DNA Typical sequence length (bp) Location Satellites (>106 repeats/genome) 5-100 Tandem arrays, scattered throughout the genome Minisatellites (>103 loci/genome) 20-300 Tandem arrays up to 5 kb in length, scattered throughout the genome Microsatellites (>104 loci/genome) 1-6 Tandem arrays up to a few 100 bp in length, scattered throughout the genome Telomeres 4-8 Tandem arrays up to 1kb in legth, at the ends of each chromosome SINEs (>105/genome) 50-500 (100-300) Interspersed throughout the genome LINEs (>103/genome) 1-5 k Interspersed throughout the genome (Minisatellite) DNA fingerprinting (Jeffreys et al. 1985) • první celogenomový screening • • restrikční štěpení kompletní DNA – sekvenčně specifické restrikční endonukleázy Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza rozštěpené DNA • Southern blotting – přenesení DNA na membránu dobrý + - „smear“ Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza • Southern blotting – přenesení DNA na membránu • hybridizace se značenou sondou (nejčastěji radioaktivní značení), tj. specifickou sekvencí odpovídající danému minisatelitu (popř. SINE) 123345 Minisatellite DNA fingerprinting • elektroforéza • Southern blotting – přenesení DNA na membránu • hybridizace se značenou sondou, tj. specifickou sekvencí odpovídající danému minisatelitu • zásadní objevy např. mimopárové paternity u ptáků • v posledních cca 20 letech – přesun k PCR-based metodám (respektive NGS metodám) RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) Krátké náhodné oligonukleotidy (~ 10 bp) jako primery PCR za málo specifických podmínek Wicki08 a) Změna sekvence v místě nasedání primeru b) Delece místa nasedání primeru c) Velká inzerce mezi dvěma místy nasedání primeru Variabilní DNA detekovaná metodou RAPD: RAPD Krátké náhodné oligonukleotidy (~ 10 bp) jako primery PCR za málo specifických podmínek Detekce PCR produktů elektroforézou - + Nízká opakovatelnost v důsledku mnoha faktorů ovlivňujících PCR – dnes již není akceptována jako metoda např. pro studium populační struktury (ale třeba vhodná jednoduchá metoda k odlišení příbuzných druhů) AFLP (amplified fragments length polymorphism) •levná, jednoduchá, rychlá a spolehlivá metoda na generování stovek informativních genetických markerů •současný screening mnoha různých DNA oblastí distribuovaných náhodně v genomu •lépe reprodukovatelná než RAPD – obsahuje krok se specifickou PCR •„genome scan“ – hledání asociací s fenotypovými znaky Princip AFLP metody („generating AFLP markers“) Generating AFLP markers multi-locus genotype image002 „capillary version“ PCR with primers on adaptors Automatizované čtení elektroforetogramu podle zadaných kritérií (např. pozice a minimální výška píku) image002 Ex.: Combination MseI + EcoRI Vyhodnocení dat – např. shluková analýza