Analýza genové exprese Genome Transcriptome Proteome DNA mRNA Proteins Transcription Translation Genomics Transcriptomics Proteomics GP_FA7TYN03040706_inv 3 billion bases 20-30,000 genes ~100,000 proteins Functional Genomics Rozdíly v expresi genů mohou mít velký význam •humans and chimpanzees are 98.7% identical in their genome sequences, but large tissue-specific differences exist in expression – particularly in the brain (Enard et al. 2002) • bush-chimp Analýza genové exprese (1) Kvantifikace kandidátních transkriptů (2) Microarrays (3) RNAseq (transkriptom) Kandidátní geny - relativní kvantifikace pomocí standardů •Měření úrovně exprese (např. v různých typech tkání nebo treatement vs. non-treatement atd. •mRNA → reverzní transkripce → cDNA → PCR •housekeeping geny – slouží jako standard pro měření •stejný počet kopií ve všech buňkách •exprimované ve všech buňkách, nezávislé na experimentu • A gene which is to be used as a loading control (or internal standard) should have various features - see slide. Srovnání množství PCR produktu na elektroforéze Studium kandidátních genů - qPCR §většinou nespecifická detekce (SYBR Green, aj.) §nutné srovnání s house-keeping geny https://www.youtube.com/watch?v=y8tHiH0BzGY We can plot the Ct values for the dilutions against concentration - the result is a linear graph. It should have an excellent correlation coefficient (certainly more than 0.990). IRBP gene CYTB gene Relative quantity = CYTB/IRBP Quantification of number of mitochondria 2.JPG 1.JPG 3.JPG it is not an expression study! Microarray transcriptomics Microarray analysis of transcriptome (~ specific DNA hybridization) Target (i.e. mix of transcripts in a form of cDNA = mRNA přepsaná do DNA reverzní transkriptázou, tj. neobsahuje introny) Probe (i.e. synthesized oligonucleotides complementary to particular genes) The GeneAtlas System Sledování exprese genů (microarrays) •Sledování exprese mnoha (tisíce) genů najednou •Založeno na hybridizaci •Sleduje se rozdíl vůči kontrole ("heterologous hybridization") = dvoukanálový experiment http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f2/Cdnaarray.jpg Vyhodnocení chipu – analýza obrazu (srovnání úrovně exprese mezi kontrolou a experimentem) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0e/Microarray2.gif Komerčně dostupné pro kompletní transkriptom cca 25 druhů (další jsou rychle vyvíjeny, i na zakázku) desítky tisíc transkriptů Commercial or custom microarrays Agilent Technologies http://www.affymetrix.com/fa/images/logo/affymetrix.png RNA-seq Differential gene expression (DE) studies in non-model species without the need for prior genomic resources Figure 2 Todd et al. 2016 Adapted from Zeng and Mortazavi, Nature Immunology 13 (2012) RNA-Seq workflow for gene expression analysis Fragmented mRNA List of differentially expressed genes RNA-Seq = sekvenování transkriptomu Využití HTS RNA-Seq quantification Musí být znám referenční transkriptom (RPKM = reads per kilobase per million reads) RNA-seq commercially available from 245 USD/sample Adapted from Zeng and Mortazavi, Nature Immunology 13 (2012) RNA-Seq workflow for gene expression analysis Fragmented mRNA List of differentially expressed genes gene ontology identifikace funkce daného genu RNA-Seq = sekvenování transkriptomu Gene ontology (http://geneontology.org/) = functional annotation analysis •založena na databázích dostupných anotovaných genů u modelových organismů •Cellular Component - the parts of a cell or its extracellular environment •Molecular Function - the elemental activities of a gene product at the molecular level, such as binding or catalysis •Biological Process - operations or sets of molecular events with a defined beginning and end, pertinent to the functioning of integrated living units: cells, tissues, organs, and organisms. Gene ontology as a graph diag-ontology-graph.gif Example: A set of terms under the biological process node pigmentation. Microarrays vs. RNA-seq media/image1.jpeg Měly by dávat stejné výsledky, ale srovnávacích studií je velmi málo Příklady Figure 1 Figure 2 Figure 3 20721 SNPs (ddRAD) – no genetic difference at neutral loci Only differentially expressed genes are responsible for morphological changes (zobák, zbarvení) Mason and Taylor 2015 http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2164-15-754-1-l.jpg •cca 334 miliónů sekvencí („reads“); 42 mil./sample • •210 DEGs („differentially expressed genes“) – 119 up-regulated, 91 down-regulated u žlutých jedinců • • xanthophory melanophory erythrophory Konzistence výsledků •změny v expresi jdou stejným směrem u RNA-seq i RT-qPCR vybraných genů • Functional annotation clustering (= gene ontology) up-regulated in yellow down-regulated in yellow •xanthophory u žlutých jedinců jsou asociovány s melanogenezí •v dalším kroku je možné studovat roli jednotlivých kandidátních genů •