(DNA-)proteinové komplexy Bi7015 - Chemické vlastnosti, struktura a interakce nukleových kyselin (doc. Fojta) DNA-proteinové komplexy Komplexy spojené s transkripcí (až 5% genomu) Komplexy spojené s duplikací genomu Komplexy podílející se na opravě genomu Chromatinové strukturní komplexy http://npidb.belozersky.msu.ru/ 5000 struktur v PDB (v roce 2014) G E N O M Protein-proteinové interakce: připomenutí sekundární a terciární struktura • proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají více vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“ • části proteinů/domény/motivy interagují s partnery – domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar jejího povrchu, ale … – charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce aminokyselin směřujících do solventu, takže … – interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …) Podívejte se u „svých“ proteinů na jejich interakce v databázích a v PDB… Tvarová a nábojová specifita DNA determinuje typy DNAvazebných domén (oproti velké rozmanitosti protein-proteinových interakčních domén) - proteiny interagují s cukrfosfátovou kostrou (fosfát) nebo přes žlábky s bazemi (vod. vazba, tvar šroubovice) - Interakce sekvenčně nespecifické (kostra – histony; strukturně specifické - HMG proteiny) nebo sekvenčně specifické (kostra+žlábky – kombinace: BglII (AGATCT) a BamHI (GGATCC) kontaktují stejné báze a „čtou“ zakřivení okolní DNA …) „shape readout“ zakřivení kostry souvisí se sekvencí B-DNA ELIXIR: DNATCO.ORG: Cerny et al, NAR, 2016 „shape readout“ zakřivení kostry - souvisí se sekvencí a prostředím Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 + triplex, kvadruplex … Vazba DNA-protein může indukovat změny - vazba proteinu může indukovat změny ve struktuře DNA - vazba DNA na protein často indukuje změny v jeho struktuře - případně u nestrukturovaných proteinů strukturu indukuje (cJun/c-Fos = šroubovice až po navázání dimeru na DNA) 1jj4 (… např. histony) 2kei, Lac represor (Leu do malého žlábku) Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 Vazba proteinů s DNA prostřednictvím solných můstků• fosfáty mohou interagovat s Arg a Lys – solné můstky/salt bridges (pozitivní náboje Arg a Lys vytváří vazbu s negativním nábojem fosfátové skupiny) • Elektrostatický náboj/povrch naznačuje vazebné schopnosti proteinu Gajiwala & Burley, COiSB, 2000 Minor groove Minor grooveMajor groove Major groove sekvenčně-specifický protein kontaktuje báze („direct“ readout) – skrze velký nebo malý žlábek – velký žlábek je lépe přístupný – vodíkové vazby (donor vs akceptor elektronu) DAA mADA Jak odliší protein různé páry bazí? “base readout” Pozice donor vs akceptor + metyl skupina metylace Ade u bakterií změna! AAD ADA CH3 AAD ADAm Vazba proteinů s DNA prostřednictvím vodíkových vazeb • Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny • Ade zbytky C-6(NH2) a N-7 mohou tvořit specifické vodíkové vazby s Gln a Asn • Gua může tvořit specifické vodíkové vazby s Arg Silná vazba, sekvenčně specifická - afinita nM – mM Slabá vazba, strukturně specifická - afinita mM – mM Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 - více jak 70 SCOP superrodin (strukturních motivů) - dle sekundárních struktur – -šroubovice (17), b-listy (7), smíšené /b motivy (48) přes aromatické AMK (base stacking) + triplex, kvadruplex … Motivy DNA-vazebných domén • Zipper typ – Leucinový zip – Helix-loop-helix • Helix-otáčka-helix – HTH – Winged helix – TALE • Zinkový prst – bb zinc-finger – Hormon-receptor – Loop-sheet-helix – Gal4 • Histon, HMG-box • b-sheet motivy -šroubovice b-listy Luscombe et al, Genome Biology, 2000 Motivy DNA vazebných domén • Zipper typ (dle způsobu dimerizace) – Leucinový zip (tzv. bZIP = basic) (transkr. fakt. yGCN4, c-Jun/c-Fos=AP-1) • 2 α-šroubovice • coiled-coil (>30AMK, Leu, C-term) • bazická část (N-terminus, navazuje na CC) • bazická šroubovice vázána do VŽ Interakce bazických AMK: Arg(232+240)=PO4, Arg(243)=Gua Konsensus sekvence: TGACTCA kvasinkový GCN4 – regulace genů pro syntézu AMK PDB: 1YSA 1YSA 1YSA Jonesaspol.,NAR,2003 NUCPLOT Konsensus sekvence: TGACTCA GCN4 https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ Efferl&Wagner,NRC,2003 Wikipedie AP-1 Efferl&Wagner,NRC,2003 Wikipedie AP-1 Kombinace – různá specifita/afinita homo/hetero heterodimery Motivy DNA-vazebných domén • Zipper typ (dle způsobu dimerizace) – Leucinový zip (tzv. bZIP = basic – transcr. fact. yGCN4, c-Jun/c-Fos) • 2 α-helixy (2 x 60 AMK) • coiled-coil (30AMK, Leu, C-term) • basická část (N-terminus, navazuje na CC) • bazická šroubovice vázána do VŽ – Helix-loop-helix (c-Myc/Max, MyoD) • CC a bazické části jsou odděleny smyčkou • bazická šroubovice vázána do VŽ • smyčka poskytuje větší flexibilitu pro vazbu šroubovice-smyčka-šroubovice Motivy DNA vazebných domén • Zipper typ – Leucinový zip – Helix-loop-helix • Helix-turn-helix – HTH – Winged helix – TALE • Zinkový prst – bb zinc-finger – Hormon-receptor – Loop-sheet-helix – Gal4 -šroubovice • Obsahuje vzájemně kolmé šroubovice ➢-helix pro vazbu na DNA („recognition“) - b-obrátka – druhá šroubovice ➢Sekvenčně-specifická vazba prostřednictvím „recognition“ šroubovice a velkého žlábku ➢nejčastější motiv u prokaryot homodimery vážou palindromatické sekvence ➢HTH motiv se obvykle vyskytuje ve svazku 3-6 šroubovic (stabilizovaných hydrofobním jádrem) ➢motiv může být buď součástí hlavního proteinu (Cro) nebo z něj může pouze vybíhat (LacI) Helix-turn-helix motiv (HTH) Luscombe et al, Genome Biology, 2000 AMK motiv: KDRWR DNA sekvence: TTAGGG (komplementární: CCCTAA) TRF2 (myb) doména – vazba na telomery (Shelterin komplex) PDB: 1W0U „Winged“ helix (okřídlená šroubovice) Gajiwala & Burley, COiSB, 2000 Luscombe et al, Genome Biology, 2000 - „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a b-listy, které poskytují další kontakty s DNA (smíšený /b typ) Méně často křídlo ve VŽ a cukr-fosfátová kostra se šroubovicí (hRFX1) HTH wing Interakce bazí se šroubovicí (H3) a křídla s cukr-fosfátovou kostrou Méně často křídlo ve VŽ a cukr-fosfátová kostra se šroubovicí (hRFX1) PDB:1BC8,SAP-1 Histon H1/H5 interaguje s DNA vybíhající z nukleosomů (kompaktnější struktura) – WH doména může vytvářet více kontaktů (interagují: H2, H3 i křídlo s 3 DNA řetězci) PDB:5NL0 PthXo1 23 repetic obtáčí DNA ve VŽ Mak et al, Science, 2012TALEN technologie Transcription activator-like effectors (TALE) Patogenní bakterie injikují do rostlinných buněk ovlivňují transkripci hostitelských rostlinných promotorů Interaguje otáčka/turn spíše než šroubovice, PDB: 3V6T Tandemové repetice (34) AMK v pozicích 12 a 13 určují specifitu (repeatvariable diresidue) – hlavní: HD, NG, NI, NN, NS, HG Mak et al, Science, 2012 Interaguje otáčka/turn spíše než šroubovice Motivy DNA-vazebných domén • Zipper typ – Leucinový zip – Helix-loop-helix • Helix-otáčka-helix – HTH – Winged helix – TALE • Zinkový motiv – bb zinc-finger – Hormon-receptor – Loop-sheet-helix – Gal4 -šroubovice Zinc-finger/Zinkový prst - cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních b-listech a -šroubovici - smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ koordinovaný 4xCys nebo 2xCys + 2xHis (tetraedrická struktura) C2H2 motiv: Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His Zinc-finger/Zinkový prst - cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních b-listech a -šroubovici - smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ koordinovaný 4xCys nebo 2xCys + 2xHis (tetraedrická struktura) C2H2 motiv: Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His - 3x v Zif268, PDB=1zaa - -šroubovice se váže do VŽ - v tandemu obtáčí VŽ - AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK => sekvenční specifita - AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK v těchto pozicích lze dosáhnout různé sekvenční specifity - -šroubovice váže 2, 3 nebo 4 sousední páry bazí - nejčastější jsou kontakty Gua-Arg - Gua se může vázat i na His, Lys, Ser - Ser se může vázat na T či A Zif268 - Dobře charakterizované DNA-proteinové kontakty –je známá specifita ZFs pro všech 64 možných kombinací 3 sousedních bp - Lze pro specifickou sekvenci DNA poskládat ZFs – nová technologie „zinc nuclease“ pro genové manipulace http://zf.princeton.edu PersikovaSingh,NAR,2014 „genome editing“ - Dobře charakterizované DNA-proteinové kontakty –je známá specifita ZFs pro všech 64 možných kombinací 3 sousedních bp - Lze pro specifickou sekvenci DNA poskládat ZFs – nová technologie „zinc nuclease“ pro genové manipulace Transcription activator-like Perez-Pineraaspol.,COiCB,2012 šroubovice ve VŽ 64 variant pro všechny triplety otáčka ve VŽ 2 AMK na 1 bázi - CTCF obsahuje 11 zinkových prstů – k vazbě na DNA používá v různých org. různé kombinace ZF Ohlsson a spol., TiG, 2001 CTCF - CTCF (zkratka z CCCTC factor) - izolátor/insulator brání transkripci … Braccioli a spol., Ess in Bioch, 2019 CTCF - CTCF interaguje s kohesinem a vytváří TAD (topologicky asociované domény) - sousední domény jsou „ nezávislé“ (izolované) Cremer a Cremer, GCC, 2019 izolátory Loop-sheet-helix - smyčky vycházející mimo hlavní core doménu – vyčnívá b-list a α-šroubovice - 3 Cys a 1His koordinují Zn - helix ve velkém žlábku a smyčka v malém žlábku - Aktivace transkripce skrze kyselou TA doménu - core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené DNA (nádorový supresor) TFIID,TFIIH - transkripce MDM2/MDM4 - ubi Loop-sheet-helix - Konsensus sekvence PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy (v promotorech p21, PUMA) - 95% “nádorových” mutací je v „core“ doméně (R273H) - Regulace/aktivace modifkací C-koncové domény Protein se váže jako tetramer (C-koncová doména) - core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené DNA (nádorový supresor) Gal4 - 2 α-šroubovice - 6 Cys koordinuje 2 Zn (2 Cys sdílené 2 Zn) - 1. šroubovice ve velkém žlábku a smyčka k 2. šroubovici kontaktuje cukrfosfátovou kostrou - Dimerizuje přes krátký CC segment Marmortstein et al.: Nature, 1992 - transkripční faktor reguluje v kvasinkách metabolismus galaktosy (kvasinkový dvou-hybridní systém) Gal4 PDB: 1D66 Motivy DNA vazebných domén • Zipper typ – Leucinový zip – Helix-loop-helix • Helix-otáčka-helix – HTH – Winged helix – TALE • Zinkový prst – bb zinc-finger – Hormon-receptor – Loop-sheet-helix – Gal4 Transkripce … Kombinace více proteinů … Vliv chromatinu … IFN-b enhanceosom Efferl & Wagner, NRC, 2003 Wikipedie IFN-b enhanceosom integrace různých signálů IFN-b enhanceosomAP-1 NF-kB Panne et al, Cell, 2008 Panne, CO in SB, 2008 - jeden z nejlépe popsaných enhancerů u vyšších eukaryot – induk. viry - sekvence -102 až -47 básí upstream od počátku transkripce - TF pokrývají 72% povrchu DNA (těsné sbalení DB-domén) – málo PPI - nicméně vazba 8 proteinů je koordinovaná (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-kB) transkripce c-Jun ATF-2 AP-1 Activator Protein = b-ZIP (basic leucine zipper) IFN-b enhanceosom http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=122 AP-1 leucin zipper, IRF – podobný WHD (směs), NFkB – komplexní motiv červené tečky – molekuly vody - TF obsahují aktivační doménu – na AD se važe mediator komplex – integruje/propojí TF – zprostředkuje vazbu s RNA polymerasou - iniciaci transkripce mediator Boijaetal,Cell,2018 Tuttleetal,CellRep,2018