EXTRACELULÁRNÍ VEZIKULY
V KONTEXTU KARCINOGENEZE
RNDr. Vendula Hlaváčková Pospíchalová, Ph.D.
pospich@sci.muni.cz
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
14. 5. 2024
Úvod k extracelulárním vezikulům (=EV)
• EV jsou malé váčky ohraničené dvojitou lipidovou membránou, které jsou
uvolňovány ze všech živých buněk do jejich okolního prostředí.
• Historicky
pojmenovávány
různě, což vedlo k
chaosu v oboru
• 2011 – založení ISEV
(International
Society for Extracellular
Vesicles) –
zastřešující termín
EV
EV v mezibuněčné komunikaci
• Důležitá role - přenášejí informace a molekuly mezi buňkami a podílejí se
na všech biologických procesech, včetně imunitní odpovědi, regenerace
tkání i patologických procesech jako je karcinogeneze
• EV obsahují různé druhy bioaktivních molekul
• Lipidy (fosfolipidy a cholesterol)
• Proteiny (membránové proteiny, enzymy, receptory a signalizačních molekuly)
• Nukleové kyseliny (DNA, RNA a mikroRNA)
• Sacharidy a další metabolity
• Které mohou ovlivňovat chování a funkci cílových
buněk
Klinický význam EV
• Zrcadlo mateřské buňky - EV
prostřednictvím svého komplexního
složení odrážejí identitu a aktuální
stav buňky, ze které vznikly,
• EV cirkulují v tělních tekutinách
• EV dokáží ovlivňovat funkce a
fenotypy ostatních buněk.
• Tyto vlastnosti naznačují silný
biomarkerový a terapeutický
potenciál, což vyvolává široký zájem
o studium EV
https://doi.org/10.3389/fonc.2020.580874
Historie EV
doi: 10.1002/jev2.12144.
Definice EV
• Současně platné směrnice v oboru:
• Minimal information for studies of extracellular
vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches
• EV jsou částice uvolňované z buněk, které jsou ohraničeny lipidovou
dvojvrstvou a nejsou schopny se samy replikovat
www.isev.org
https://www.isev.org/misev2023
Typy EV
https://doi.org/10.1038/
s41577-022-00763-8
• Exosomy –
vznikají z endosomálního
kompartmentu,
tzv.
multivesikulárníc
h tělísek (MVB –
multivesicular
bodies)
• Ektozomy (dříve
mikrovezikuly,
mikropartikule) –
vznikají pučením
z cytoplasmatické
membrány
1.Exosomy - uvolňované exocytózou multivesikulárních těl (MVBs) a amfisomů (ty vznikají fúzí
autophagosomů a MVB).
2.Ektosomy: Vznikají pučením a vypouklým odlučováním plazmatické membrány,
1. Malé EV:
2. Mikrovezikuly: Středně velké EV.
3. Apoptotická tělíska: Větší EV uvolňované během apoptózy.
4. Viry: Uvolňované z plazmatické membrány ve formě en bloc jsou podobné MVB
5. Onkosomy: Velké EV produkované nádorovými buňkami.
6. Migrasomy: Uvolňované z migrujících buněk z konce dlouhých retrakčních vláken
7. Midbodies: Uvolňované po cytokinezi dělících se buněk.
8. Ciliární ektosomy: Uvolňované z plazmatické membrány cilií.
9. Apoptopodie: Uvolňují apoptotické buňky.
10.ENDs: Elongated neutriphil-derived structures – zbytky po rolujících neutrofilech v cévách
11.Ikkosomy: Vznikají z folikulárních dendritických buněk
12.TMPs: T-cell microvilli particles – součástí imunologické synapse
13.Exofery: Velké EV visící na konci stopky, obsahující poškozené organelly a proteinové agregáty
14.Sekreční autophagosomy: Uvolňovány buňkami.
Cargo EV
• Uvnitř, v membráně i na povrchu (tzv.
EV corona)
• Povrch vs. Objem EV
• Typické cargo
nabohacené v EV
+ cargo odrážející
buňku původu
Cesty exosomů
• Biogeneze v MVB
(mutivesikulárních tělíscích)
z ILV (intraluminální vesikuly)
• Uvolnění do extracelulárního
prostoru exocytózou
• Pobyt v extracelulárním
prostoru – např. tělní tekutiny
• Interakce s cílovou buňkou
• Přenesení informace/obsahu
exosomů a důsledek pro
cílovou buňku
https://doi.org/10.1186/s12964-021-00730-1
Biogeneze exosomů
1) Internalizace carga endocytotózou
z extracelulárního prostoru
2) sorting do časných endosomů
3) Vznik intraluminálních vesikulů
(ILV) a sorting carga do nich
4) Maturace do pozdních
endosomů/multivesilukárních
tělísek (MVB)
5) Transport MVB k cytoplasmatické
membráně
6) Tzv. dokování MVB a jejich fúze s
cytoplasmatickou membránou
7) Uvolnění exosomů do extracelulárního
prostoru exocytózou https://doi.org/10.1186/s12964-021-00730-1
Vznikají z ILV = intraluminální vesikuly
ILV se tvoří invaginací membrány v MVB
• 3 různé mechanismy –
• ESCRT dráha
• Syndecan-syntenin-ALIX dráha
• Ceramidová dráha
Selekce carga exosomů
• ovliňují selekci
carga exosomů
https://do
i.org/10.1
038/
s12276-
024-
01209-y
Interakce s
cílovou
buňkou
• Tzv. uptake exosomů
• Hlavní mechanismy
přenos informace:
1) Interakce ligandreceptor
(přímá
signalizace)
2) Membránová fúze
(uvolnění carga
do cytosolu)
3) Endocytóza a
následný únik z
endosomů/lysozo
mů
DOI: 10.5772/61186
DOI 10.15252/embj.2021109288
Role EV v kontextu
karcinogeneze
• Exosomální sekrece je klíčová pro
rozvoj nádorových onemocnění
• Inhibice produkce exosomů
rakovinnými a buňkami nádorového
stromatu vede k redukovanému
růstu nádoru a snížené schopnosti
metastázovat
• Zapojení EV do všech aspektů karcinogeneze,
od interakce mezi hostitelem a
mikrobiotou, až po systémové účinky nádorů
Zvýšená sekrece EV během karcinogeneze
Vlivem na MVB např:
• Hypoxie
• Sníženého pH
• Invaze
• Chemoterapie
Nádorové buňky:
• SRC – stimulace Alix
dráhy ILV
• Rab31 – stimulace
ceramidové dráhy
• ARF6 – stimulace
vzniku ektosomů DOI 10.15252/embj.2021109288
Změněné cargo EV během karcinogeneze
DOI 10.15252/embj.2021109288
• Selektivní balení integrinů – role v tvorbě
premetastatické niky
- α6β4 a α6β1 - tropismus k plicím
- αvβ5 - tropismus k játrům
• onkoprotein EGFR – wt i mutovaný
umožňuje parakrinní přenos aktivovaného
EGFR na méně agresivní nádorové
buňky a na endotelové buňky
(pozitivní zpětná vazba s Rab31)
• onkoprotein MET – podporuje metastáze
EV podporují
karcinogenezi
mnoha
způsoby
• Pokračování na
dalším snímku
DOI 10.15252/embj.2021109288
EV - Organotropismus a premetastická niky (pmn)
• Vliv povrchových receptorů jako jsou integriny a CEMIP na EV
EV ve formování pmn
• Přijetí EV stromálními a imunitními
buňkami indukuje vytvoření pmn,
která jsou silně přívětivá pro
usazování a růst nádorových buněk
• Hlavní změny spojené s tvorbou pmn:
proliferace endotelových a lymfatických
buněk, vaskulární permeabilita,
rekruitment imunitních buněk, aktivace
rezidentních imunitních buněk,
remodelace ECM a metabolické
reprogramování CAF a TAM
• EV uvolněné primárním nádorem po
chemoterapii a radioterapii se také
podílejí na tvorbě pnm
Využití EV v onkologii:
1. EV jsou ve všech tělních tekutinách a jejich
cargo, které reaguje na karcinogenezi i terapii,
může být rezervoárem biomarkerů
využitelných k predikci typu rakoviny v raných
stádiích a terapeutickým odpovědím
2. Přirozeně nízká toxicita a široké rozšíření EV v
tkáních je činí žádoucími a autologními nosiči
chemoterapeutik, genetického materiálu nebo
zobrazovacích činidel (např. radiokontrastní
látky), jsou slibnější než liposomy
3. EV jako terapeutický cíl - cílená produkce a
uptake EV pro management nádorových
onemocnění
EV jsou slibnými nanonástroji v onkologii
Next generation technology: A world in which
cancer diagnosis is possible from a simple blood
draw. (Credit: Exosomics Siena S.p.A. via
www.exosomics.it/technology)
Biomarkery EV definují různé lidské nádory
• Hoshino et al., 2020, Cell 182, 1044–1061
• Proteomické profily EV ze 426 lidských vzorků
• Identifikace univerzálních markerů EV
• Charakterizace markerů EV odvozených z
nádorů v lidských tkáních a plazmě
• Proteiny EV mohou být užitečné pro
detekci rakoviny a určení jejího typu
• Další studie identifikovaly specifické
proteiny EV, které mohou mít prognostickou
a prediktivní hodnotu pro detekci
nádoru, progrese a terapeutickou odpověď
Tekuté biopsie
• Využití EV z tělních tekutin jako prediktivních markerů, typu nádorového onemocnění
a stadia nemoci je zvláště důležité v případě absencí tkáňových biopsií
• Také pro screenování populace ve velkém měřítku
Výhody a nevýhody EV v tekutých biopsií
• Nutnost izolace čisté populace EV
• Časová i finanční náročnost izolace,
separace a charakterizace EV
• Značná inkonzistence výsledků vlivem
různých metod
• Nedostatečná znalost biologie EV
Výhody Nevýhody
• EV obsahují nabohacené biomarkery v krvi v podstatně vyšších koncentracích a dříve
během karcinogeneze než cirkulující nádorové buňky (CTC) nebo nádorové antigeny
• Vývoj mikrofluidních zařízení představuje slibnou alternativu - není nutná izolace EV
www.biotium.org
Non-vesicular extracellular particles (NVEP)
• Nevesikulární extracelulární partikule
• Multimolekulární sestavy, které jsou
uvolňovány z buněk a nemají lipidovou
dvojvrstvu: lipoproteinové částice (LPP),
ribonukleoproteinové částice (RNP), viry
nebo exomery a supermery.
• NVEP a EV často mají překrývající se
fyzikálně-chemické vlastnosti, a NVEP
bývá v biologických matricích mnohem
více než EV
• Kolik je ve krvi EVs? 10^6 – 10^12/ml
• Snahy o standardizaci
• Směrnice MISEV2023
Veerman RE et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2021
UC
SEC
Studium EV
Mnoho výzev díky:
• Malá velikost a velká
heterogenita - EV se liší
velikostí, obsahem a
vlastnostmi v závislosti
na biogenezi, původu a
funkci.
• Nedostatek
standardizovaných
metod pro izolaci a
charakterizaci - různé
izolační protokoly v
závislosti na analýze
nákladu.
+ Super-resolution microscopy
Nomenklatura v praxi:
EV ≠ exosom
• MISEV2023 doporučuje používat
obecný termín „extracelulární
vezikuly“, případně jeho operační
rozšíření (např. malé EV, CD63+ EV),
které jsou odvozené od metody
izolace/nabohacení EV
• namísto nekonzistentně definovaných
a někdy zavádějících termínů, jako
jsou „exosomy“ a „ektosomy“, které
jsou spojeny s cestami biogeneze a ex
post (v komplexním vzorku jako je
plasma, ale i kondiciované médium) je
obtížné je stanovit, protože neznáme
specifické markery pro subtypy EV
Ukázka experimentu s EV
Validace EV
A) Kryo-elektronová
mikroskopie - tvar
a kontaminanty
B) Dynamický
rozptyl světla
(MADLS) - velikost,
polydispersita,
koncentrace
C) Western blot (WB)
- markery EV +
"negativní marker"
D) Barvení celkových
proteinů
EV jako nosiče léčiv
• Můžeme je například upravit tak, aby nesly specifické molekuly, jako jsou
cytostatika či terapeutické miRNA, a efektivně je dopravily do cílových buněk. Tento
přístup otevírá dveře pro další možnosti cílené terapie
• Dietární EV (z mléka, ze zeleniny a ovoce a džusů)
https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.05.002 https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2017.07.010
Od základního výzkumu ke klinickým aplikacím
• Základní výzkum týkající se izolace, standardizace a charakterizace EV
přinese naplnění translačního potenciálu pro diagnostiku a terapii
https://doi.org/10.1002/wnan.1835
Česká společnost pro extracelulární vezikuly
zech ociety or E tracellular Vesicles
@czesev.czsci.muni.cz/czesev czesev@sci.muni.czCzesev@CzeSEVCzesev