Základy klinické onkológie Experimentální metody v onkológii Opáčko Sustaining proliferative signaling Evading growth suppressors Deregulating cellular energetics^ Avoiding immune .destruction Resisting cell death mm Enabling replicative immortality Genome instability & mutation Tumor-promoting inflammation Inducing angiogenesis Activating invasion & metastasis Obsah • FISH • PCR a varianty • Izotermální amplifikační metody • Sekvenování • Detekce mutací • Detekce DNA metylace • Lateral flow assay FISH • Fluorescence in situ hybridization • Lokalizace specifických sekvencích na chromozomech pomocí fluorescenčního mikroskopu • Genetické poradenství, dědičné onemocnění, identifikace druhů (evoluční podobnost) FISH BCR-ABL —► • BCR <— ABL BCR-ABL ■ • Fúze genů na dvou různých chromosomech • BCR (Chromosom 22) a ABL (Chromosom 9) • BCR::ABL fúze Filadelfský Chromosom • Diagnostika chronické myeloidní leukémie (CML) nebo specifického typu akutní lymfoblastické leukémie (ALL) Polymerázová řetězová reakce • PCR - exponenciální in vitro amplifikace krátkého úseku DNA • 1983 - Kari Mullis (Nobelova cena 1993) • Konečně to šlo bez klonování • Potřebujeme: dva primery (forward a reverse), Taq polymeráza, deoxyribonukleotidy, termální cykler • 3 opakující se kroky; 2n kopií při n cyklech (30 cyklů ~ 109 kopií) Polymerázová řetězová reakce DNA Cycle 1 3*1 3*1 3*1 Primer fc 5^111111111111111111 OM 3' 5 3 n iL 7 .' If IL 7 Í V molecule Q Denature, e.g., 95QC for 15 seconds f3' 5 Q Anneal oligonucleotide primers, e.g. 55°C for 30 seconds 3' HQ I'"*c' Primer 5 Q Extension of primers with Jaq polymerase, e.g., 70DC for 1.5 minutes f3' ? 2 molecules Cycle 2 Q Denature I ^ 1 %j Anneal oligonucleotide primers 5...................................i/ /......................................> 3 7f 3' HO IIIIIIIIIIIIIIIIIIP5 .......> OH 3' 5*1 Primer Primer .................■*: 1M1111M M11111111 3 3*1 5a Primer 3' HO^I I^OH 3' Primer }j J....................................... 5 Q Extension of primers with Taq polymerase ^■MINIMI Mill MM 11 llll Mill I Mill! /111IIIIIII1111II111IIIIIII1111II111II if 3 // \J/....................................... 5 \ \ Repeat cycle: of Steps 1-3 3*1 1M1111 M M11111111 iM 1111 M M111111111 3' 5illllllllllllllllll .................-c > 4 molecules 3 cycles-8 molecules 4 cycles-16 molecules + 5 cycles-32 molecules J ID cycles-lD24 molecules 30 cycles-1,073h74L,766 molecules Reverse-transcription PCR (RT-PCR) Templat: RNA Single-step vs two-step Trnrr Gene-specific primers 1l dNTP Mix Water DNA polymerase Reverse transcriptase Amplified cDNA RNA template Varianty PCR Nested PCR first outer primer set targeted \ sequence -rV T I 1rtAmplicon • — — — J enter 2nd PCR second inner primer set I — — ■ 2nd Arnpllcon - J 1 Varianty PCR Nested PCR Asymmetric PCR first outer primer set targeted sequence T lrtAmplícon enter 2nd PCR second inner primer set abundant primer non-targeted strand targeted strand limiting primer targeted single strand DNA double strand DNA PCR Kvalitativní Real-time PCR Relativní kvantifikace Droplet Digital PCR Absolutní kvantifikace Gelová elektroforéza - metoda detekce PCR produktů • Nejčastější koncová detekce PCR produktů • Jednoduchá, účinná, relativně levná • Méně citlivá, semi-kvantitativní, limitující množství vzorků 100 Real-Time PCR Též qPCR, citlivá, sledování v reálném čase, dražší něž klasická PCR Fluorescenční barvička interkaluje do dsDNA (SYBR Green) Electrostatic interaction Groove-binding Minor groove Intercalation >- Major groove Threading intercalation SYBR Denature Polymerization g ^^^^^^^^^^^^^ Signal detection (Polymerization completed) ^ ^ ^™ Real-Time PCR TaqMan Annealing Primer „ Q 0 | Probe J Primer Polymerization & strand displacement ^\ Probe J Cleavage ^ (8 Signal detection (Polymerization completed) Real-Time PCR ARn 2,000,000 - 1,000,000 - 0 Plateau Exponential phase PCR cycle number LiqhtCvcler (FRET) • FRET = fluorescence resonance energy transfer B FRET TRANSFER ACCEPTOR OR I PTOR 1 1 CFP EMISSION EMISSION ABSORPTION A8S0RPTION DONORS ACCEPTORS BFP GFP CFP dsREO Cy3 CyS Alexa488 AiexaSS5 Alexa488 Cy3 FITC TRITC Dabcyl EOANS ABZ DNP DANSYL TYR(NO,) DANSYL FAM 400 500 WAVELENGTH INM) LiahtCvcler (FRET) Využití v Real-Time PCR 3' Donor Fluorophore (F„) Oligo Probe 1 5' Acceptor Fluorophore (F,) F. Oligo Probe 2 Amplified Target DNA 1. Probes in solution emit low fluorescence 2. Emission through fluorescence resonance energy transfer Molekulární majáky Využití v Real-Time PCR Molecular beacon Reporter fluorophore 5' Quencher ddPCR (Droplet digital PCR) Umožňuje absolutní kvantifikaci (počítá molekuly DNA v malých kapičkách s přesně definovaným objemem v nanolitrech) Kapičky - emulze voda/olej, jedna kapička „nahrazuje" jednu zkumavku ddPCR systém rozdělí DNA vzorek na cca 20 000 kapiček, v každé probíhá nezávislá PCR reakce Analýza pomocí Poissonového rozdělení (výpočet původního množství DNA na Základě flUOreSCenCe) samplel Sample2 Sample3 Sample4 o-c V\ ^ G-ÍMK. Ok f J No targ9t Low concentration Medium concentration High concentration ddPCR (Droplet digital PCR) dPCR (Digitální PCR) Nanoplate-based digital PCR syst _J>OOOOv -ooooooc ^oooooooc oooooooo ooooooooo >oooooooo ooooooooo oooooooo ooooooooo "OOOOOOOO "5000000 "OOOOf- 5 QIAGEN OOO OOi I Target I Background (gDNA, cDNA; primers/probes; master mix) PCR reaction partitioning into thousands individual reactions w ^ooo oc OOO OO t DOOOOC Positive reactions Negative reactions Absolute quantification _ kace ^ Cloning cDNA or DNA and nuclotide sequencing Detection of Mutations and modification of DNA Identifying a disease's genetic tendency Detecting genetic disorders associated with heredity diseases Detecting cancer and determining the degree of the disease PCR applications Imaging, diagnosis and treatment of viral infections Pathogen presence tests Forensic practices Microbe detection and characterization Recognition of emerging infectious diseases *5 76 DNA microarravs • Umístění tisíců DNA sond na deštičku, na každý spot jinou • Cílová DNA/RNA je naznačena fluo rotore m • Po promytí hodnotí počítač • Vhodné pro mikroRNA analýzu, genovou expresi, SNP,... Healthy cell _/\/\/\ s\/\s\ Cell types i Culture RNA isolation I Pathological cell s\/\s\ s\s\s\ S\S\S\ Reverse transcription S\S\S% ./X/X/* S\S\S\ S\S\S\ and fluorescent tagging S\S\S% Hybridization onto microarray DNA microarravs • Umístění tiSÍCŮ DNA SOnd na DNA Microarray deštičku, na každý spot jinou presemmcens Oinn°rma|ce||s°n|y Izotermální amplifikační techniky • enzymatické reakce s exponenciálním charakterem • nevyžadují cyklování teplot, reakce probíhá při jedné teplotě • vysoká rychlost amplifikace (20-30 min) • tolerují PCR inhibitory Izotermální amplifikační techniky enzymatické reakce s exponenciálním charakterem nevyžadují cyklování teplot, reakce probíhá při jedné teplotě vysoká rychlost amplifikace (20-30 min) tolerují PCR inhibitory LAMP o z angl. loop-mediated amplification o probíhá při teplotě (cca 55-70 °C) o ideální pro detekci patogenů o RT-LAMP pro Covid-19 F3c F2c F1c 3 — - - n primer /"fip ximer 5 F3 F2 F1 B1 B2 B3 B1c B2c B3c BIP primer FIP 1 Exponenciální amplifikace https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw Izotermální amplifikační techniky enzymatické reakce s exponenciálním charakterem nevyžadují cyklování teplot, reakce probíhá při jedné teplotě vysoká rychlost amplifikace (20-30 min) tolerují PCR inhibitory LAMP o z angl. loop-mediated amplification o probíhá při teplotě (cca 55-70 °C) o ideální pro detekci patogenů o RT-LAMP pro Covid-19 F3c F2c F1c 3 — - - n primer /"fip ximer 5 F3 F2 F1 B1 B2 B3 B1c B2c B3c BIP primer FIP 1 Exponenciální amplifikace https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw RCA • rolling circle amplification • běží při teplotě 23-60°C • vhodná pro mutační analýzu • není exponenciální cílová DNA kruhová DNAsonda hybridizace -> ligace konců purifikace https://www.youtube.com/watch?v=3N39R2as-84 Izotermální amplifikační techniky enzymatické reakce s exponenciálním charakterem nevyžadují cyklování teplot, reakce probíhá při jedné teplotě vysoká rychlost amplifikace (20-30 min) tolerují PCR inhibitory cílová DNA kruhová DNA sonda LAMP o z angl. loop-mediated amplification o probíhá při teplotě (cca 55-70 °C) o ideální pro detekci patogenů o RT-LAMP pro Covid-19 F3c F2c F1c 3 — 5> F3 primer B1 B2 B3 f FIP primer 5 F3 F2 F1 B1c B2c B3c BIP primer B3 primer FIP 1 Exponenciální amplifikace https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw RPA RCA • rolling circle amplification • běží při teplotě 23-60°C • vhodná pro mutační analýzu • není exponenciální https://www.youtube.com/watch?v=3N39R2as-84 hybridizace -> ligace koncu purifikace recombinase polymerase amplification běží při teplotě 25-42°C exponenciální, rychlá (20 min) vhodná pro LFA Izotermální amplifikační techniky • Detekce vysoce rizikových kmenů HPV (způsobujících nádory děložního hrdla): HPV16aHPV18 Ar 1. Boil, 5 min 2. LAMP,66°C75 min HPV positive TIME Cervical sample in lysis buffer Ladder-like LAMPamplicons HPV negative TIME f» Tosyl , Epoxy i Cloromethyl Izadi et alv Anal Chim Acta 2021 Sekvenování Labelling of the end of the DNA with 32P 32P CCT TGC GTTG C + T U Chemical cleavage With Dimethyl sulphate 32PACCTATGCAGTTGA 32P CCT TGC 32P CCT Chemické (Maxam-Gilbertovo) sekvenování - rok 1976 - příprava koncově značených jed n o řetězcových fragmentů - 4 paralelní vzorky: modifikace jednoho typu báze, kde je fragment štěpen Chemical cleavage With Piperidine Chemical cleavage With Hydrazine NaCI Chemical cleavage With Hydrazine 32P CCT TGC GTTG 32P CCT TGC GTTG 32P CCT TGC GTTG 32P CCT TGC GTT 32P CCT TGC 32P CCT T I 32P CCT TG 32P C 32P 32P CCT TGC GT 32P CCT TGC G 32P CCTA 32P CC Sequencing Gel Sekvenování Enzymatické (Sangerovo) sekvencování - 1977 - Syntéza komplementárního vlákna k sekvenci kterou identifikujeme - 4 paralelní vzorky: do každého jeden dideoxyribonukleotid který zastavuje amplifikaci dATP<. +dGTPs + dCTPs + dTTPs Taq DNA polymerase Forward primers Reverse primers Template DNA CCT TGC GTTG CCTATGCA ACCTA A CCT TGC GTTG ACCTATGCAGTTG ACCTATGCAG CCT TG CCT TGC GTTG ACCTATGC CC C CCT TGC GTTG ACCTATGC AGTT CCTATGCAGT CCTAT CCT ddATPs ddGTPs ddCTPs ddTTPs Ribose HO-CH2 ■n Dideoxyribose Traditional Sanger sequencing method Sekvenování Pyrosekvenování -1993 - Přidává se vždy po jednom dNTP, pokud se inkorporuje, vyzáří se světlo díky přítomnosti luciferázy - Neintegrované dNTP jsou odstraněny apyrázou "I—I—I—I—I—T A G C C A A T C G J_I_I_L_ DNA Polymerase i—i—i—i—i—r G G A A A C oxyluciferin Luciferin G ^Py P Pi pj Sulfurylase + Luciferas dNTP, dNMP, Phosphate dNTP Apyrase ATP ADP, AMP, Phosphate A G TT -> Time Sekvenování Nová generace sekvenování (NGS) - levnější a robustnější („high-throughput") technologie (masivní paralelní sekvenování) - miliony sekvencí jsou čteny najednou - umožňuje objev genů a regulačních elementů, identifikaci mutací,... - RNA sekvenování - analýza celého transkriptomu Limitace: - Značná pořizovací cena, relativně drahé analýzy pro menší rutinní laboratoře - Méně přesné čtení templátu (homopolymery), kratší délky sekvenovaných oblastí (cca 150-500 nukleotidů) - Náročná analýza dat i ■ I ' > *.< V Four types of NGS applications Q Whole Genome Sequencing (WGS) Q Exome Sequencing (Exome-Seq) Q RNA Sequencing (RNA-Seq) ^ Methylation Sequencing (Methyl-Seq) NGS lllumina Stručný protokol Príprava knihovny Vytvoření clusterů Sekvenovaní Analýza dat MiniSeq System Power and simplicity for targeted sequencing. MiSeq Series Small genome and targeted sequencing. NextSeq Series Everyday genome, exone transcriptome seauencing, and more. HiSeq Series Production-scale genome, exome, transenptome sequencing, ana nore. HiSeq X Series Population- and Droductio"-scale h^man whole-genome sequencing. NovaSeq Series Population- and production scale genome, exome. transenptome sequencing, and more. NGS lllumina A, Library Preparation Genomic DNA I 1 Fragmentation Adapters icjsat (in 'Sec uencing Library NGS library is prepared by fragmenting a gDNA sample and ligating specialized adapters to both fragment ends, Fragmented input DNA End Repair dA Tailing Adaptor Ligation Size Selection Amplification Next Generation Sequencing NGS lllumina B. Cluster Amplification now ecu Bridge Amplification Cycles <> me nil tíiň w\ 'Bifl.iS'fl, Clusters Library is loaded into a flow cell and the fragments are hybridized to the tlow cell surface. Fach bound fragment is amplified into a clonal cluster through bridge amplification. 1. DNA Flow cell 6. Clonal copies of both forward and reverse strand in a cluster. Reverse Strand Jj DNA folds over into a bridge-like shape. J—L J-L Forward Strand Primer J—L Complementary (Reverse) strand is made. J—LL C. Sequencing Ouster 1 > Read 1: GAGT... Duster 2 > Read 2: TTGA... Cluster 3 > Read 3: CTAG... Cluster 4 > Read 4: ATAC... Text File Sequencing reagents, including tluorescently labeled nucleotides, are added and the first base is incorporated. The flow cell is imaged and the emission from each cluster is recorded. 1 he emission wavelength and intensity are used to identify the base. This cycle is repeated "n" times to create a read length of "n" bases. D. Alignment and Data Anaylsis Reads ATGG CATTG CAATTTG ACAT TGGCATTGCAATTTG AGATGGTATTG GATGG CATTG CAA G GATT G CAATTTG AC ATGG CATTG CAATT AGATGG CATTG CAATTTG Reference Genome AG ATGG TATTGC AATTTGACAT Reads a re align ed to a reference sequence with hi a informatics software. After alignment, differences between the reference genome and the newly sequenced reads can be dentified. NGS lllumina • v onkológii zejména TruSight Oncology 500 = sekvenace panelu cca 500 genů (523) • komplexní genomické profilování nádorů (z FFPE vzorků nebo krve) • Analyzuje DNA i RNA • stanovuje nádorovou mutační nálož (TMB) a mikrosatelitovou nestabilitu (MSI) jako imunoterapeutické markery DNA VARIANTS SNVs 10 BIOMARKERS MSI INDELS O TMB / CNVs Fusions RNA VARIANTS NGS Ion Torrent • Polovodičové sekvenování • Změna pH při inkorporaci dNTP, měření ISFET • Žádná optika, žádné modifikované nukleotidy -y- Example: 'S dNTPs Pnmer ~0* :'.fi ] SD 111 @ 0 I ] é i ] 1 /fl 5 1 p', -V----' Template ta cgta cgta nucleotides NGS Oxford Nanopore • Třetí generace sekvenování • Změny elektrického potenciálu při průchodu • Délka čtení > 10 kb • Přímé real-time sekvenování bez značení nanopórem Metody na detekci DNA mutací • Techniky založené na kvantifikaci DNA (qPCR) • DNA sekvenování • přístupy zaměřené na stanovení délky DNA fragmentů (RFLP) • MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) • HRM (high-resolution melting analysis) Metodv na detekci DNA mutaci • RFLP (restriction fragment length polymorphism) vzorek A vzorek B GAATTC CTTAAG GTATTC■ CATAAG 1. reštrikční štěpení G ATTC CTTAA G GTATTC — CATAAG — vzorek A je štepěn vzorek B vlivem polymorfizmu restrikčního místa není štěpen 2. elektroforéza A B Metody na detekci DNA mutací MLPA Vhodné pro detekci delecí, inzercí, CNV nebo aneuploidie Stačí jeden set primem na několik targetů DENATURACE (98°C) HYBRIDIZACE (98°C) LIGACE (54°C) PCR 4 ds DNA ss DNA ss DNA Dvě speciální sondy hybridizující vedle sebe Ligáza SEPARACE inaktivace ligázy při 98°C použití univerzálních primerů (fluorescenčně značených) fragmentová analýza (kapilární elektroforéza) Metody na detekci DNA mutací • HRM (high resolution melting) • Detekce mutací, polymorfizmu nebo DNA metylace • Plně komplementární duplexy mají vyšší teplotu tání než SNP duplexy • Real-time monitorování separace duplexů zvyšováním teploty * iitvxiM » :>: •'.■« "< w n: »* «» f> ní ft* m nt m m> •»• »t m* ti mi ttt «;< *>* t Kt mi c» «.-» u t» m m DNA metvlace - metody analýzy • bisulfitová konverze + metyl-specifická PCR Cytosine NH, H3C NH I Sugar HSO-, O Alkaline Uracil 0 ^NH N^O 1 Sugar B Original unmethylated DNA After bisulfite treatment After PCR amplification No modification Sugar 5-methylcytosine Original methylated DNA After bisulfite treatment After PCR amplification A-G- -T- -G-A- -G-T-C-A A-G-U-T-U-G-A-U-G-T-U-A A-G- -T- -G-A- -G-T- -A A-G-C-T-mC-G-A-mC-G-T-C-A A-G-U-T-mC-G-A-mC-G-T-l -A A-G- -T-C-G-A-C-G-T- -A DNA metvlace - metódy analýzy • reštrikční štepení pomoci metyl-senzitivních enzýmu nemetyloyaná Hpall Mspl 5' ||c C G G 3' 5' C m5C G G 3' metylovaná Hpall Mspl C mí C c G Q Blocked A quick review of relevant DNA methylation restriction enzymes. Product DNA Methylation Application Recognition Site MspJI Identify 5-hmC and 5-mC 5'... "X:NNR(n)9 v...3' 3'.. GNNY(N)„A_.5' LpnPI Identify 5-hmC and 5-mC 5'...CmCDG(N)10V3' 3LGGHC(N)UA...5' FspEI Identify 5-hmC and 5-mC SICQN),/.^ 3'_GG(N)ltA.5' Dpnl Identify 5-mA; used with Dpnll 5'...GATC...3' 3'_ CT AG-.5' CM Dpnll Identify 5-mA; used with Dpnl 5L*GATC~3' 3'... CTAGA._5' McrBC Identify 5-mC S'-Pu-XKN^Pu-CJ' Mspl Identify 5-mC; used with Hpall 5'_CTCGG..3' 3'_GGCAC-5' Hpall Identify 5-mC; used with Mspl 3'...GGCAC...5' další analýza pomocí různých technik DNA metylace - metody analýzy • afinitní purifikace pomocí protilátek nebo MBD proteinů DNA metvlace - metody analýzy 5m 5m ORIGINAL DNA SEQUENCE: CCCCGGGCGGAAGCTGCGGGCGG Treatment with sodium bisulfite DNA SEQUENCE AFTER BISULFITE CONVERS PCR amplification and sequencing SEQUENCING READC • Methyl-seq (bisulfitové sekvenování) • Porovnání před a po konverzi UNMETHYLATED C i i DNA metvlace - metody analýzy • Schválené diagnostické testy Galleri test • první multi-cancer early detection test (MCED test) • detekce metylované DNA v krvi, analýza cirkulující nádorové DNA metodou NGS a „machine learning", výsledek do 10 dní • nehrazeno v USA, doplňkové vyšetření, u některých typů nádorů nízká přesnost 50+ cancer types A B C E The Galleri test detects a signal shared by 50+ cancer types. In clinical studies, the following cancers were diagnosed after a Cancer Signal Detected result with the Galleri test.1 Adrenal Cortical Carcinoma Bile Ducts, Dista Cervix Esophagus and Esophagogastric Junction Ampulla of Vater Colon and Rectum Anus Bile Ducts, Perihilar Appendix, Carcinoma Bladder, Urinary Bone Breast https://grail.com/galleri-test/ https ://www.youtube.com/watch ?v=ZqkuKb9yqVA&t= 135s DNA metylace - metody analýzy • první krevní test pro screening CRC schválen FDA • pro pacienty kteří nechtějí kolonoskopii • test detekuje hypermetylaci promotoru genu septin9 metodou Real-Time PCR s bisulfitovou konverzí • negativní test = není přítomný CRC (specifičnosti testu: 94%) • pozitivní test = 45,7% pravděpodobnost výskytu CRC, doporučena kolonoskopie (nízká citlivost) • není hrazen ZP Lateral flow assays • Rychlé, levné, jednoduché (těhotenský test, antigen Covid test,...) • Paper-based, kvalitativní ale ne kvantitativní • Pozitivní výsledek ve formě proužku • Príklad v onkológii: Přítomnost onkovirů Detekce bodových mutací Detekce onkomarkerů (proteinů) Čas na hru Kahoot.it