ANALÝZA A SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN LITERATURA GENE CLONING & DNA ANALYSIS IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Důraz kladen na čistotu nikoliv množství - PCR CÍL IZOLACE ■ Odstranění proteinů ■ DNA vs RNA ■ Izolace specifického typu NK Í.1UÍJ 1 typy nk ■ genomická (chromosomalní) ■ organelová (mitochondrie, chloroplasty) ■ plasmidy (extra-chromosomalní) ■ virová (ds nebo ss) ■ komplementární (mRNA) nejpoužívanější metody ■ na základě rozdílné rozpustnosti - extrakce, srážení ■ na základě vlastností - chromatografie - polarita-adsorpční, náboj-ionexová ■ sedimentace - gradientova ultracentrifugace MUNI SCI postup 1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK 2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). 3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. ■ Extra kce/Precipitace ■ Chromatografie ■ Ultracentrifugace EXTRAKCE/PRECIPITACE 1 A culture of bacteria is grown and then harvested 2 The cells are removed and broken to give a cell extract Centrifugation Bacterial culture \ Pellet of cells Cell extract 4 TheDNAis concentrated Pure DNA 3 The DNA is purified from the cell extract Izolace genomické DNA Typická procedura 1. Sklizení buněk 2. Lyse buněk 0.5% SDS + proteinase K (55° několik hodin) 3. Fenolová extrakce Jemné třepání několik hodin 4. Ethanolová precipitace 5. Působení RNAsy a proteinasy K 6. Opakování kroku 3 a 4. Ext ra kce/ P re c i p i ta ce Extrakce/Precipitace Přidání EtOH a soli 2-2,5 objem EtOH -20° C Vysoká I pH 5-5.5 Krok 5: Působení RNAsy Detail kroku 5 CHROMATOGRAFIE Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie Krok 1: Příprava lyzátu Krok 2: Adsorpce na silikagel A: ozz -3 Ce-t- vga^e Extrakci* puf r pro vazbu DNA a RNA na silikagel: • nízké pH vysoká iontová síta • cnaotropní soli L adsorpcni chromatografie Adsorpční chromatografíe Krok 3: Vymyti kontaminant - y »: Krok 4: Eluce NK / m s L Ekiiní puf r: Vysoké pH Air ká iontové sita r i u n i Ionexová chromatografíe Vazba při nízkém pH nízké I CH2CH3 H© CH2CH3 0-CH2CH2-aa ^ ^ OCHoCH-,-1 CH2CH3 CH2CH3 Eluce zvýšením pH nebo vysokou I DEAE (diettiylaminoetfianol) Base Bose Chemical structure of DNA GRADIENTOVA CENTRIFUGACE Dělení částic lišící se navzájem svou velikostí (molekulární hmotností), probíhá pomocí centrifugace v tzv. sacharózových gradientech, tj. v roztocích sacharózy, jejichž koncentrace u dna centrifugační zkumavky je vyšší než u hladiny (lineární gradienty 5 - 20% sacharózy). Vzrůstající hustota roztoku a tím i jeho viskozita eliminují odstředivé zrychlení působící na částice, jehož hodnota se směrem od OSy Otáčení zvyšuje. Gradient tak zajišťuje konstantní rychlost sedimentace částic, podmiňuje jejich stabilitu a snižuje difúzi usazených částic do okolí. K přípravě gradientů lze použít rovněž dalších látek, např. D 20, ficoll aj. Používá se gradientů chloridu česného - dělení dle odlišné specifické hustoty. Roztoky CsCl se vyznačují vysokou hustotou a při centrifugaci samovolně vytvářejí koncentrační a tím i hustotní gradient. Gradient je určen počáteční koncentrací CsCl a rychlostí otáčení. K ustálení gradientu dojde během Bněkolika hodin. Biomakromolekuly, které se na počátku centrifugace promíchají s roztokem CsCl, se při centrifugaci usadí ve vrstvě roztoku (gradientu), odpovídající jejich vznášivé hustotě (její hustota je poněkud odlišná od specifické hustoty). Gradientova centrifugace DNA CsCl Protein Linear and oc DNA Supercoiled DNA Pias \^^^-RNA (a) An EtBr-CsCI density gradient IZOLACE RNA - SPECIÁLNÍ PRÍSTUPY NUTNO POUŽIT INHIBITORY RNASY extrakce guanidium chloridem fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) působení RNase-free Dnase selektivní precipitace rRNA, mRNAs LiCI oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA WĚ Kontrola NK • spektrofotometricky • kvalita • kvantita • selová elektroforéza • kvalita ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN pcr MULLIS 1983 NC 1993 Templätovä DNA, primery, NTP, Taq polymeräza (75-80°C) thermocycler Step 1 I 5' 3' [ r Separate strands by heating to 95 °C. 5' I Target sequence II III IV II' III' IV V V 3' I 5' I 3' 3' [ 5' Figure 13-11 parti Concepts in Biochemistry, 3/e © 2006 John Wiley & Sons 3' 5' Time Metodika umožňující mnohonásobné zmnožení (amplifíkaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace Taille attendue du fragment "PCR" Reakční směs obsahuje: 1) vodu 2) nukleotidy (dNTP) 3) reakční pufr 4) primery 5) termostabilní DNA polymerázu 6) templátovou nukleovou kyselinu (DNA) 7) případné přídatné látky THERMOCYCLER real time pcr slouží pro kvantifikaci DNA a transkripce. založena na klasické PCR, kontinuální záznam množství DNA v průběhu každého cyklu. kvantifikace umožněna přítomností fluorescenčního substrátu, který se váže na přítomnou DNA. hladina fluorescence substrátu navázaného na DNA je detekovaná detektorem a odráží množství přítomné DNA, tj. i množství výchozího templátu. real-time PCR se obvykle provádí v 96-ti jamkových destičkách. Pro detekci cílové DNA je real-time PCR je vysoce citlivou metodou a pokud jsou využity specifické fluorescenční substráty, tak je to i metoda vysoce specifická. real time pcr 1. Navázání: SYBR® Green i se váze během každého cyklu na dvouvláknovou DNA. 1. Polymerizace: Fluorescenční substrát (reportér - R) a jeho zhášeč (Q) jsou navázány na 5' a 3' konce TaqMan sondy. 2. Denaturace: Ve fázi denaturace DNA je SYBR® Green I uvolněn z vazby na DNA a celková fluorescence dramaticky klesá 2. Elongace řetězce: Dokud je sonda intaktní zazení emitované substrátem R je pohlcováno blízkým "zhášečem". 3. Polymerizace: Během annealíngu primerú a elongace fetězce se Sybr Green opět začíná navazovat na vznikající dvouvláknovou DNA - fluorescence stoupá. M VI BIÍ PWMfK 3. Odštěpení: když Tag polymeráza dorazí k začátku sondy, postupně ji odchhpuje až odštěpí fluorofor. Ten se tímto oddálí od zhášeče a emitované světlo přestane být pohlcováno - detekovaná fluorescence stoupá. 4. Ukončení polymerizace: Emitovaná fluorescence dosahuje maxima. 4. Polymerizace ukončena: reportérova barva oddělená od zhášeče emituje charakteristickou fluorescenci. 5'i 3" 5' Försterova vzdálenost 1-10 Lim REALTIME PCR REALTIME PCR Real-time PCR je založena na konceptu Ct hodnoty (Ct jako cycle of treshold, cyklus prahu). Ct hodnota reflektuje cyklus, kdy dochází k nárůstu fluorescence nad práh pozadí, které se v reakci vyskytuje. Tato fluorescence je zachycena detektorem. Číslo tohoto cykluje zaznamenáno a dále využíváno právě jako Ct hodnota. Přitom je důležité si uvědomovat, že čím je Ct nižší, tím více bylo do reakce dodáno templátové DNA, a naopak. Pokud budeme uvažovat, že účinnost PCR reakce je ideálních 100%, lze rozdíl v koncentraci templátové DNA nanesené do reakce u srovnávaných vzorků, vyhodnotit jako rozdíl v Ct hodnotách. Tj. jako 2 ACt, kde ACt je rozdíl v Ct hodnotách mezi srovnávanými vzorky. REAL-TIME PCR Oblasti využití • Analýza genové exprese • Detekce geneticky modifikovaných organismů • Detekce a kvantifikace patogenů REAL-TIME PCR PROTEINŮ Advantage of the ability to precisely control and rapidly change the temperature of a large number of small volume samples while monitoring sample fluorescence. Available excitation and emission wavelengths correspond to those of the dyes commonly used as reporters for nucleic acids. intrinsic fluorescence of tyrosine and tryptophan residues cannot be detected -utilization of green fluorescent protein (GFP), the addition of a reporter dye (SYPRO orange), or naturally fluorescent proteins VW A probe O _ ľVA/* B probe Im I lir>>iľ.:i:;i U SCI I c Jita ^-*/ SY i mí y i rvivi J *.....111*1 J" v REALTIME PCR PROTEINU Concentration stanovení sekvence dna ■ Reštrikční enzymy ■ Chemické štěpení - Maxam Gilbertovo metoda ■ Enzymová metoda ■ Pyrosekvenování reštrikční enzymy Ejw y m Hľľíiľii: Iíiin SuLfuťncc' Vild ľ-TBľTnrd-rn JJxvrrHl ImKV Jj'rf]J .■j... 1.1 Jj\ynJLIL J l.-.u. 11 .lďr,lJj jvi^ri .Vnľrn] :i.:i -.:-r-KK3 Rtj-TOC+Tr 1 r-n»-r..řu+i-ir- ňŕ/j-..: j'Jlc-n., i cu.-íujfá ŕ."n .'LL'lj- l'z.'jj ĽLn'i JtilŠ .■jiiTiirn-nr R^ wi-ii:iifŤW,ii^.*r A'nllhmnri reštrikční enzymy (a) EcoRl (b) EcoBV 5'— G Á -A-T -T- C 3' 5'- —G A T 1 A -T- c- T 3' C T TA A j ■G— 5' 3' C -T -A-T -A- G- v Cleavage site Twofold sym Chromosome I DNA has 3 target sites 2 — A-H-*-E Chromosome II DNA has only 2 of the target sites 1 3 UNI SCI I A B Cleave with restriction enzyme and electrophorese Fragment C is the size of A + B combined REŠTRIKČNÍ ENZYMY maxam gilbertova metoda í- 32 32 P 5 ; 32r dsDNA značená na 5'- koncích Separace řetězců. ssDNA H A + G T + C U V kazete zkumavce je DNA štěpena chemickým činidlem, které selektivně štěpí jeden rte t) o dva typy hází, \ Separace vytvořených fragmentu elektroforézou. I 3' G A C T C C G A A 5' A u to r a d i o g r a f/e a odečet sekvence z autoradiogramu. A+G T+C MAXA M GILBERTOVA METODA radioaktivní značení na 5' konci DNA (typicky pomocí kinázy s použitím gama-32P ATP) a purifikace fragmen který se má sekvenovat. 2) Chemické působení vytváří zlomy v malé frakci u jedné nebo dvou bází ze 4. v každé se 4 reakcí: (G, A+G, C, C+T). guaniny (G) (a částečně i adeniny) se methylují dimethylsulfátem pyrimidiny (C+T) - báze se odštěpují hydrazinem. Přídavek soli (NaCl) k hydrazinu inhibuje methylaci thyminu, reakce je pak specifická pro C. 3) Modifikované DNA jsou pak štěpeny v horkém piperidinu v pozici modifikované báze. Tím se vytváří soubor značených fragmentů od značeného konce až po první štěpení v každé molekule. \) Fragmenty z jednotlivých reakcí jsou naneseny na elfo vedle sebe v „_ r% \ s~~* t-1 _____ _________:____ii____1:1___j.' t ti____ Jenaturujícím PAGE pro separaci podle velikosti. Vizualizace pomocí autoradiografie (rtg fíl^metylsulfát a piperidin hydrazin a piperidin ENZYMOVÁ METODA Sangerovo sekvenování (Chain-termination seq., dideoxy-seq.) UNI SCI Template strand 3' HO- TGATCGATCGA A C Primer strand -OH.V Tube I d ATP + ddATP dGTP dTTP dCTP dATP dGTP + ddGTP dTTP dCTP ACT.4 ACTAGCT/L ACTAG ACTAGCTAG Electrophoresis gel dATP dGTP dTTP + dUTTP dCTP Tube 4 dATP dGTP dTTP dCTP + ddCTP ACT ACTAGCjT ACTAGC ACTAGCTAGC/ ACTAGCTAGf Resulting X-ray image of primer strand sequence ACTAGCTA 3' T - C G A T C G A T 5'" G C T Extension of primer strand -OH 3' Figure 11-30 Concepts in Biochemistry, 3/e © 2006 John Wiley & Sons 2003 - PROJEKT LIDSKEHO GENOMU MCitUDE THE DIFFEDENCE ■Four times the throughput -Lowest sequencfnft cost per base •More genomes per we*k 'Better eflklenclss: less labor and lest tpa:o C api ltar> array* Cacti of su arrays Ms cspilancs Array wlirdoww_ Ttia part <-i detection TtiB n tna scannng contocal laser elective A no do chimb or . -A manxts rjectad -c ■ pressure '■ ■ - Cithoda via go CNA urrtacs ara irrjorua anurartaaLEfy PYROSEKVENOVÁNÍ První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. Pozn. Nové sekvenační metody tzv. druhé generace (Next Generation Sequencing, NGS) opět využívají syntézu DNA podle templátu, ale na rozdíl od Sangerovy metody jsou schopny detekovat přidávání bází jednu po druhé a zároveň sekvenovat tisíce až miliony rozdílných molekul DNA najednou. pyrosekvenovAni Iterative additions PYROSEKVENOVANI ■ První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. ■ Vzniklý pyrofosfát je uvolněn z polymerázy a může sloužit jako substrát pro ATP sulfurylázu. Při této reakci dojde ke kvantitativnímu převedení pyrofosfátu na ATP pyrosekvenovAni Iterative additions PYROSEKVENOVÁNÍ ■ Během třetí a čtvrté reakce je ATP převedeno na světelný signál pomocí enzymu luciferázy a následně je světelný signál detekován a vyhodnocen programem. pyrosekvenovAni Iterative additions PYROSEKVENOVÁNÍ ■ Poslední enzymatickou reakcí je reakce apyrázy, která odstraní nezainkorpované nukleotidy a ATP, aby následně mohlo dojít k zopakování celého výše popsaného procesu a mohlo být analyzováno zařazení dalšího nukleotidu. Tato degradace je nezbytná, aby bylo zajištěna synchronizace mezi syntézou a detekcí světelného signálu. pyrosekvenovAni Iterative additions pyrosekvenovAni Process Overview 1} Prepare Adapter Li gated ssDNA Library 2) Gfonal Amplification on 28 p beads 3) Load beads and enzymes in PicoTiterPlate™ 4) Perform Sequencing by synthesi oo the 454 Instrument 454 PYROSEKVENOVÁNÍ r.2005 Technologie využívá paralelní sekvenace: více než 1-2 milion sekvencí zároveň. -Lze získat až 1GB (gigabázi) informace během jedné analýzy (cca4.5 h). Využití: -sekvenace genomů (náhodně naštěpená genomová DNA je sekvenována a sestavena) - studium metagenomů (tj. souhrn všech genů, přítomných v daném prostředí, používá se DNA extrahovaná ze vzorku půdy, vody, sedimentu, mikroflóry střeva ad.) - tzv. amplikonové sekvenování. Vlastní sekvenaci předchází PCR zacílená na 16S nebo 18S geny prokaryot a eukaryot - analýza typu „shotgun" - veškerá DNA / RNA, získaná ze vzorku Zařízení je velmi nákladné (cca 17 mil. Kč), analýzy jsou ale dostupné komerčně, takže většina laboratoří v současnosti využívá služeb externích sekvenačních středisek. SEKVENOVÄNI 1.000.000.000 -I ^ 100.000.000- o 10.000,000- E & g- "O S. CO I O 1.000,000-100.0000 10,000-1.000-100-10 mo Massively parallel sequencing Capillary sequencing Short - read sequencers Microwell pyrosequencing Gel-based systems Automated slab gel Second-gerteratton capillary sequencer slab gel F irst-generat K>n capillary 1980~ 1985 1990 1995 2000 Year 2005 2010 Future Stratton et al. 2009 Nature 458:719-724 genetická daktyloskopie POUŽITI RESTRIKCNICH ENZYMU - RFLP RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM Geny i nekódující úseky DNA se mohou vyskytovat v různých variantách na párových chromozomech. Jedna varianta se dědí od matky, jedna od otce, proto označení párové chromozomy. Rozdíl může být v jednom, nebo více nukleotidových párech. Pro existenci této metody byl nezbytný objev restrikčních enzymů (tzv. endonukleáz), které dokážou rozštěpit DNA na jednotlivé úseky. Ty jsou poté elektroforeticky separovány a přeneseny z elektroforetického gelu na nitrocelulózovou či nylonovou membránu. Polymorfismus těchto fragmentů je potom detekován za omoci hybridizace a účasti specifických hybridizačních s s u u D D E E H N C C E E *1 *Z J short tandem repeats 100 120 140 160 160 200 220 240 260 2 60 3Q0 320 ! D3S1358 AVPROFI...US LADDER 4 Blue PROFILER PLUS LADDER ......... I T_&| [1 1 mm OH ia 21 13 21 13 16 19 [22 24 27 JO 25 28 20|[23l[2J 29 26.2 Norma 14 ■2000 10DD EE hort tandem repeats (STRs) jsou krátké sekvence DNA, známé ko mikrosatelity, které se tandemově opakují (opakuje se úsek -6 bp dlouhý). short tandem repeats testy paternity Zjednodušené testy ■ STR na Y chromosomu - mužských potomků srovnání s otcem ■ Mitochondriální DNA - dědí se po matce - matroklinní dědičnost MUNI SCI dnachipy DNACHIPY @52001900552056050706401000885092 @52002900588841112406401511225338 DNACHIPY Mask 1 — Photosensitive — Iprotecting groups I 1 Light f f ¥ ¥ f f O O O O O O Growing oligonucleotides 1. deprotection W W h ? H W O O O O O O T Glass substrate Mask 2 T-1 2. chemical coupling ¥¥¥¥¥¥ O O T O T O O O T O T O "M 4. O G T G T O C T C G T G G G A A G T A G T G T C Fixováním sond na pevný povrch je umožněno je prostorově oddělit a paralelizovat hybridizační reakce. Nukleotidová sekvence je základem pro specificitu daných sond. DNACHIPY DNA CHIPY - BARVA SKVRN DNACHIPY- VYBAVENÍ DNA CHIPY SOFTWARE 11 ^J.MÍvlLr^-^g^v.J.^ď^i^ jT ffaiBii Pur i c-r f r vi i i h* vr-^ f i:*,,h.í.-^l.L-,n! Kr* I Till □ji JOT 1111 I r öi ■Í3B ib Cyclin A !□ Cyclin B III Cyclin C iU Cyclin Dl !□ Cyclin D2 |d Cyclin D3 I Cyclin E Ii I Cyclin F id Cyclin G |d Cyclin H I Cyclin proteinové chipy PROTEINOVÉ CHIPY - TYPY INTERAKCÍ Protilátka Antigén « anti-gst probe