srážecí metody SRÁŽENÍ Nezaměňovat s denaturací - bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody používané pro separaci bílkovin EtOH, (NH4)2S04 u SCI Filtrace nahrazena centrifugací i ROZPUSTNOST BÍLKOVINY ■ Vlastnostmi bílkoviny - distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny ROZPUSTNOST BÍLKOVINY ■ Vlastnostmi roztoku -pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota IZOELEKTRICKÁ PRECIPITACE SRÁŽENÍ NEUTRÁLNÍMI SOLEMI VSOLOVÁNÍ vzrůst rozpustnosti proteinů v přítomnosti malých koncentrací neutrálních solí; VSOLOVÁNÍ VYSOLOVÁNÍ VYSOLOVÁNÍ pH, iontová síla, teplota, typ soli, koncentrace proteinů PRAKTICKÉ ASPEKTY Hofmeistrova řada Anionty SCN-, J-, CI04-, NO3-, Br, Cľ, Aer, S042", P043" Kationty Na+, K+, NH/ (NH4)2S04 Rozpustnost se málo mění s teplotou u SCI Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235 g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý SRÁŽECÍ KŘIVKA O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% SRÁŽENÍ - DVOJSTUPŇOVÉ SRAŽENI - DVOJSTUPŇOVÉ 20 ml 4F52S(NH4)2S04 oentrifupace ..S 1.16g(NH4)2S04 -> ■A 4 - peleta obsahiífcí hftxnkinasw odstranit muni SCI PŘIDANÉ MNOŽSTVÍ ■ Tabulky Initial pere entage saturation 20 25 30 35 40 45 target percentage saturation 50 J 55 1 60 J 65 70 l 75 80 85 90 95 100 0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697 5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662 10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627 15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592 20 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557 25 27 56 84 115 146 179 21 1 245 280 317 355 395 436 478 522 30 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488 35 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453 40 29 50 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418 45 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383 50 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348 55 30 61 93 127 161 197 235 273 313 60 31 62 95 129 164 201 239 279 65 31 63 97 132 168 205 244 70 32 65 99 134 171 209 75 32 66 101 137 174 80 33 67 103 139 85 34 68 105 90 34 70 95 35 u Inožství síranu amonného (g/L) potřebného pro změnu koncentrace v roztoku z původního procenta saturace na požadované nasycení při 0 °C PRIDANÉ MNOŽSTVÍ Tabulky Vzorce PROVEDENÍ úprava pH NH4OH el. míchačka SRÁŽENÍ ORG.ROZPOUŠTĚDLY MÍSITELNÝMI S VODOU Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny SRÁŽENÍ ORG.ROZPOUŠTĚDLY MÍSITELNÝMI S VODOU SRÁŽENÍ ORG.ROZPOUŠTĚDLY MÍSITELNÝMI S VODOU MU SCI Snižují dielektrickou konstantu prostředí (zvýšení elektrostatické interakce mezi nabitými skupinami biopolymeru Izolace N K koncentrovaným ethanolem Jen omezeně pro srážení proteinů při snížené teplotě (riziko denaturace); např. sérové proteiny - kromě EtOH, MeOH, aceton, ether March, 194G Skparatiom into Fractions of Protein ani> Lipoproteik Components -t.39 [ CON-TRIBUTIONT FROM THE DEPARTMENT OF PHYSICAL CHEMISTRY, HARVARD MP.I>ICA L SCHOOL, J Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV- A. System for the Separation Into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluidslabcd By 32. J. Cohn, L. E. Strong, \V. L. Hughes, Jr., I>. J- Mulford, J. >T. Ashvvmjktii, TVT. Mbcin and H. Taylor10 SRÁŽENÍ SÉROVÝCH PROTEINU dle COHNA Method 1 Method 2 Distribution of Plasma Proteins into Fractions by Various Methods Estimated by Electrophoretic Analysis and a Nitrogen Factor of 6.25 for all Proteins Fraction Method Albumin a-Globulin Cholesterol 0-Globulia 7-GlobuIio Fibp«tf Plasma 33.2 8.4 1.6 7.8 6.6 /4.3 I 1 0.3 0 0 0.2 0.7 [ 3.0 I 2 1.0 0.3 • ■ . .4 .2 I 2.4 : 5 0.2 .2 0.02 .8 .5 i C 0.3 .3 .01 .0 .3 ir 1 1.5 0 .2 1.3 3.7 0,3 III 1 1.5 .1 .3 0.2 II 4* III L> 0.6 .9 > * ■ 1.4 II + III 5 m . i 1.8 f 6 2 J V 60 J 1.6 II + CI] 6 .6 0.9 (13) 1.6 IV 1 5.6 w 3.0 0.4 0.2 IV 4.9 ( 4.9 \ v._*x 3.7 .6 0 IV 5 1.0 V 54 / 0.4 3.1 .2 0 IV-1 i i • \3.9/ .4 0.4 .04 0 IV-4 6 0.9 .04 2.2 0 0 V 1 0.3 0 0.4 0 0 V 2 1 27 0 1 .6 r ' • 0.3 0 0 V 5 I 29 0 ) .6 <.0i 0 0 0 V 6 \2SA/ 1.2 <.01 0.3 :) VI l 2*2 0.1 0.02 0 0 0 VI 2 0.5 .1 • • * 0 0 a VI 5 .3 .3 » * i 0 0 VI 6 — .7 .2 i ■ ■ 0 0 " 1 37.1 4.7 1.2 7.5 7.4 3.7 Totals 2 33.5 6.7 • • • 10.3 5.5 3.8 5 31.2 8.3 1.5 10.1 6.7 4.2 6 30.9 9.4 1.7 10.2 6.0 3.9 VÝBĚR ROZPOUŠTĚDLA Kompletně mísitelné s vodou Nereaguje s bílkovinou Musí mít dobrý precipitační efekt EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan u SCI i SRÁŽENÍ ORG.ROZPOUŠTĚDLY MÍSITELNÝMI S VODOU ■ Nutno provádět při T < 0 °C, při vyšší teplotě dochází k denaturaci ■ Dvojstupňové ■ Přídavky z tabulky nebo podle vzorce muni SCI SRÁŽENÍ ORG.POLYMERY Princip identický s rozpouštědly ■ DEAE dextran o ■ PEG h -y^o ■ Polyakrylová kyselina H H ■ Rivanol n N ■ Kaprylová kyselina h h mu ni ■ ■■■i h| SRÁŽENÍ SELEKTIVNÍ DENATURACÍ ■ Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. ■ Denaturační vlivy - T, pH, org. rozpouštědla ■ Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat TEPELNÁ DENATURACE TEPELNÁ DENATURACE ■ Doba inkubace je důležitá pouze pro re p rod u kováte I n ost - denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin m u ni TEPELNÁ DENATURACE ■ pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno ■ Při vyšší teplotě běží více proteolýza muni SCI pH DENATURACE ■ Provádět za definované teploty ■ Změny pH dělat co nejrychleji ■ Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady muni SCI pH 5 HAc pH 8 Tris pH 4 k.mléčná pH 9 DEA pH 2 H3P04, H2S04 pH 11 NaOH ■ Extrémy pH - bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu -» nutná zpětná úprava pH DENATURACE ORG.ROZPOUŠTĚDLY ■ Při srážení organickými rozpouštědly -T<0°C ■ Pří denaturaci organickými rozpouštědly -T = 20 - 30 °C ■ Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv ■ T apH musí být přesně definovány EtOH, MetOH, aceton