MUNI SCI CHROMATOGRAFICKE METODY I. LITERATURA Introduction to Modern Liquid Chromatography Practical High-Performance Liquid Chromatography Veronika R. Meyer PRACTICAL HPLC METHOD DEVELOPMENT :j i. ľ □ w n E d t t i □ n Jnaaph J. Kto-fcMrtc] ■ Ju»i*pli L Qln,lrh mikhail semyonovich tsvet chromatographia 1906 PODSTATA CHROMATOGRAFIE „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze - stacionární a mobilní." eluent vzorek r i u u i SCI m • • • arialyt leluát CHROMATOGRAFIE Mobilní fáze - kapalina- LC - plyn- GC Stacionární fáze - pevná fáze - kapalina Eluce - Izokratická - stejná eluční síla Gradientova - rostoucí eluční síla U SCI I Použití - analytická preparativní KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE LC ■ Mobilní fáze kapalina Stacionární fáze pevná fáze, kapalina PROVEDENI LC ■ Papírová PC (SF-voda nebo polární rozpouštědlo zakotvené na vláknech papíru) ■ Tenkovrstvá TLC (s ilikagel, alumina, celulóza aj.) rozprostřená na inertní podložce Kolonová CC - SF tvoří náplň kolony, neboje nanesena n. chemicky vázána na sné částice, případně přímo na vnitřním vrchu kolony TEORETICKÉ ASPEKTY CHROMATOGRAFIE teorie „ideální lineární chromatografie" martin synge 53 teorie ideální lineárn chromatografie" gc Nekonečně rychlé ustavení rovnovah Pístový tok mobilní fáze Nulová difuse Lineární sorpční isoterma píky analytůl Nanesení vzorku na kolonu CHROMATOGRAFIE eluent vzorek * * m anály t n veluát CHROMATOGRAM RETENČNÍ - ELUČNÍ ČAS TD ■ Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křivky Retenční - eluční objem Vr • Objem mobilní fáze protekly od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křivky Fm - objemová rychlost mobilní fáze DET Vr - zdánlivý retenční objem Vr- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem - mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolon KAPACITNÍ FAKTOR k' k'= 1 - 10 Vs - objem stacionárni fáze VM - objem mobilní fáze Distribuční koeficient cs - rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM - rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi SELEKTIVITA RETENČNÍ FAKTOR ÚČINNOST KOLONY (IZOKRATICKÁ ELUCE) POČET TEORETICKÝCH PATER N ÚČINNOST KOLONY (IZOKRATICKA ELUCE) VÝŠKOVÝ EKVIVALENT TEORETICKÉHO PATRA H účinnost kolony ÚČINNOST KOLONY (GRADIENTOVA ELUCE) KAPACITA PÍKU P t P = l+ g (1/*)!>» 1 t - celková doba gradientu ÚČINNOST KOLONY (GRADIENTOVA ELUCE) ROZLIŠENÍ R12=l .5 - nulové překrytí R12=1.0- překrytí 2% Y. Y. ROZLIŠENÍ VLIV JEDNOTLIVÝCH FAKTORŮ NA ROZLIŠENÍ Selektivita Kapacita Účinnost VLIV JEDNOTLIVÝCH FAKTORŮ NA ROZLIŠENÍ • faktor selektivity lze ovlivnit: -změnou stacionární fáze -změnou mobilní fáze -současnou změnou obou fází -změnou rychlosti toku mobilní fáze VLIV JEDNOTLIVÝCH FAKTORŮ NA ROZLIŠENÍ • faktor kapacity lze ovlivnit: -množstvím stacionární fáze v koloně -změnou stacionární nebo mobilní fáze -změnou teploty kolony vliv jednotlivých faktorů na rozlišení • faktor účinnosti lze ovlivnit: -délkou kolony -rychlostí průtoku mobilní fáze -velikostí částic sorbentu -teplotou, viskozitou mobilní i stacionární fáze VZNIK ELUCNI KRIVKY PEAKU (PÍKU) „DYNAMICKÁ DIFUZNÍ TEORIE VAN DEEMTER vliv rychlosti mobilní fáze na rozšiřování zón H-výškový ekvivalent teoretického patra, A-vířivá (turbulentní) difúze, B-podélná molekulární difúze, C-odpor proti převodu hmoty VAN DEEMTEROVA DIFUZNÍ TEORIE ■ Difuse turbulentní ■ Difuse molekulová ■ Odpor proti převodu hmoty DIFUSE TURBULENTNÍ A DIFUSE MOLEKULOVÁ B ODPOR PROTI PŘEVODU HMOTY C VAN DEEMTEROVA ROVNICE S minimum křivky « optimální průtoková rychlost S daná kolona vykazuje největší účinnost, nejméně rozšiřuje zóny analytů SÍLY A EFEKTY VYUŽÍVANÉ PŘI SEPARACI ■ Iontové síly Silné elektrostatické interakce mezi stacionární a analyzovanou látkou- ionexová chromatografie ■ Polární síly interakce dipólů a protondonorní, resp. protonakceptorní vlastnosti (tvorba vodíkových můstků) separovaných látek, mobilní a stacionární fáze - adsorpční chromatografie SÍLY A EFEKTY VYUŽÍVANÉ PŘI SEPARACI ■ Nepolární síly (disperzní, van der Waalsovy) Nejslabší, tyto interakce se vyskytují u látek, které nejsou permanentní dipóly - adsorpční, reverzně fázová a hydrofobní chromatografie ■ Efekt velikosti molekul Rozdíly ve velikosti a tvaru molekul - gelová permeační chromatografie M U NI SCI SILY A EFEKTY VYUŽÍVANÉ PŘI SEPARACI ■ Sterické interakce Komplexní specifická interakce ligand biomakromolekula kombinující všechny výše uvedené interakce a efekty - afinitní chromatografie ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE Použití - analytická PC, TLC PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE AMK stacionární fáze: voda mobilní fáze: butanol-kyselina octová-voda (12:3:5) ADSORPČNÍ chromatografie chromatografie s normálními fázemi ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ■ Stacionární fáze - polární nese aktivní centra, jejich počet, rozložení a schopnost poutat molekuly rozdělované směsi závisí na charakteru adsorbentu, velikosti povrchu a na vlastnostech separovaných látek M U NI SCI ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE adsorpční chromatografie ■ Stacionární fáze Silikagel Si02. n H20 Vysoký specifický povrch a relativně velký objem pórů. Hlavní součástí aktivních center jsou hydroxylové (silanolové) skupiny, na něž je vodíkovou vazbou adsorbována voda. Zahřátím na 150 °C dojde k odstranění vody ® "aktivace silikagelu". Labilní nad pH 8. > 200 °C rozklad. Adsorpce: interakce se silanolovými skupinami; povrch silikagelu je slabě kyselý (má protondonorní vlastnosti). Lépe jsou zadržovány bazické látky. adsorpční chromatografie ■Stacionární fáze Oxid hlinitý Al203, Obdobné vlastnosti jako u silikagelu (povrch, póry). Vyskytuje se v řadě modifikací, dle množství vázané vody, krystalické struktury. "Aktivace" vysušením [AI(OH)3 ® AIO(OH) ® Al203]. Při vysokém obsahu vody (15%) se projevují rozdělovači efekty. Vedle protondonorních hydroxylů se na povrchu vyskytují i centra s protonakceptorními ostmi ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ■ Mobilní fáze - nepolární ■ E luce - zvyšováním polarity mobilní fáze U SCI I Eluotropická řada: uhlovodíky bou/o) s malým množstvím vody nebo jiného polárního rozpouštědla Arialyte LOQ P -3 -2 _L -I _L 1 2 3: 1 Partition (HILIC) MeCN > H?0 Reverse Phase HzG > MeCN Typical mobile phases U 1 HILIC CHROMATOGRAFIE AC AC AC HiO AC OH AC Hi OH ACI > a H polárni stacionárni faze mobilní fáze f (acetonitril/voda) j > hydratovaná stacionární fáze hilic chromatografie ACN ACN ACN I VcH2CHCH3 w ACN k ACN 3 ACN H,0 H20 -CH2CHCH3 H0 H0 H,0 O H,0 ^ NHt 0 H,0 cr HILIC CHROMATOGRAFIE pH -3 HILIC CHROMATOGRAFIE V h,0 i h.o Analyte Analyte \Hydrophilic l Partitioning t 5 Analyte h.o 'V, Z v.. I Hp h,0 x.V x-u-z—u u 5 Weak Electrostatic Interaction Hp 8 h,o y *>° i $ Z ho 5 ho ^ Weak Electrostatic Interaction k.r it h;0 HILIC CHROMATOGRAFIE ■ Nanášení VZOrku - vzorek rozpuštěn v mobilní fázi ■ Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Dioxan>Aceton>ACN>THF>IPOH>EtOH>MetOH>H20 Použití: analýza polárních látek M U NI HILIC CHROMATOGRAFIE Water jj^ id Jul Et(OH): 1,2 ill MeOH EtOH .-3* I 1*2*3* 5'4 10 20 30 —i 40 10 —r~ 20 -i— 30 —i 40 Figure 5. Separation of the sets of nucleobases and nucleosides on (a) the TG, .: mobile phase, methanol—deionised water (75:25); flow-rate, 0.3 ml/min: detection at 254 nm. Twenty" jxl of Schiscmdra extract were loaded on the column. IONTOVĚ PÁROVÁ CHROMATOGRAFIE + - SDS, HC104 - - tetrabutylamonium IONTOVĚ PÁROVÁ CHROMATOGRAFIE Stacionární, mobilní faze, eluce - RPC pH —> plná ionizace analytu IONTOVE PAROVA CHROMATOGRAFIE (A) O 008 Ql E a 0 w 1 o t/> X; <: -J O 6 12 minutes Fig. I. Chromatogram of standards. Separation of standard containing 76.4 fiM CrP, 72 //A/ AMP, 58.53 fiM ADP and 45.35 y.K1 ATP. Injection volume: 10 /d. Flow-rate: 2 ml.min. BufTeT: 0.52 /iM potassium dihydrogen phosphate. 0.04% TBAP and 1.25% methanol, pH 4.0. Column: Supelcosil LC-18, 5 /jm (25 cm x 0.46 cm). Detection: UV 210 nm. HYDROFOBNÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze - -C , -C8/-fenyl Mobilní fáze - vodné roztoky (pufry) i.7M(NH4)2S04 Eluce - snižováním iontové síly Použití: purifikace bílkovin HYDROFOBNÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze - OH i .0-CH-CH-CH2-0-(CH2)3-C Hg Butyl Sepharose 4 Fast Flow OH i 0-CH,-CH-CH2-0-(CH2)-CH3 Octyl Sepharose CL-4B OH i -0-CH2-CH-CH2-O^Q^> Phenyl Superose Phenyl Sepharose High Performance Phenyl Sepharose CL-4B Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) OH I 0-CH2-CH-CK-0-CH2-C(CH3), Alkyl Superose HYDROFOBNI CHROMATOGRAFIE 100 °/oB activity pkat/ml] 3.0 1.0 10 20 Ve [ ml ] |Fig. 1. Chromatography of crude enzyme preparation on a Phenyl-Superose column. Buffers: (A) 0.05 M sodium phosphate (pH 7.4) with 1.7 M sodium sulphate and 1 mM EDTA; (B) 0.05 M sodium phosphate |(pH 7.4); flow-rate, 0.5 ml/min. Kc, clution volume; solid line, absorbance at 280 nm (^2«o); dashed lines, gradient; (O) G6P-DH activity; (•) LDH activity. Approximately 10 mg of protein were applied to the column. HYDROFOBNI CHROMATOGRAFIE '283 0.5 ---100"-, B 1000 20CO 3000 Figure 1 ,coc [nL3 okt. lu'xat/ml 3 20 *0 Chromatcsraphy of the crude enzyme preparation on a Spheron 1000 column. Buffers : A, 0.05 M potassium phosphate (pH 6.C) with 1.3 M ammonium sulphate and 1 uM CuSQ« ; B, D. 05 M potassium phosphate (pi- 6.0) with 1 uM CuSCU ; flow-rate 4.5 mi/min; V« — elu-tion volume; absorhnnca at 2SO run (Aa e o > ; —gradient ; ---O---DAO activity (ukat.ml- » - Approximately 30 g of protein were applied to the column. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE lONEXY ■ Katexy - ■ vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSCy slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) -CH2COC- coo Anexy - "■" vazba aniontů M U i J SCI slabé - dietylaminoetyl (DEAE) -(CH2)2-NH(CH2CH3)2 trietylaminoetyl (TEAE) SLABÝ IONEX ■ Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH ■ Má pufrační kapacitu % ' r i u r j i SCI pH SLABÝ VERSUS SILNÝ IONEX PH 12 - 10 - 8 - 6 - 4 - 12 -10 - 5 - 6 4- J í i J 4 4 j d m I Ol 1M Na CH CMQephůdeK 10 y 6 -4 - ^ i i i i i 3 4 í 6 7 S m l 0.1M NaOH UrtEQ&píiepdt-:: i i 4 A í é m I a 1M NaOH ;p Geptiůde:-: t-1-1-1-1-1-1-1 1 2 3 4 5 6 7 SI ml aiMWaOH IONEXOVA CHROMATOGRAFIE CM | Forma adsorpční chromatografie Iontová výměna je proces nazávislý na velikosti, tvaru a jiných fyzikálních vlastnostech separované molekuly VOLBA PODMÍNEK - pH + TYP IONEXU pl bílkoviny je znám Katex Ionex Anex -1 +1 H30+<-1—1—1-► OH pí 0 Bílkovina DONANŮV EFEKT zvyšování pH snižování pH VOLBA PODMÍNEK - pH + TYP IONEXU pí bílkoviny není znám • Metoda pokusů a omylů • Metoda titračních křivek IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE ■ Nanášení vzorku - nízká iontová síla MU sc ■ Eluce - gradientova ■ Zvyšováním iontové síly ■ Změnou pH ■ Afinitní eluce Použití-pu rif i kace, zakoncentrování, výměna pufru, eptidy, proteiny, nukleotidy, oligonukleotidy, ukleové kyseliny lONEXOVA CHROMATOGRAFIE 0.5 A 280 0.2 5 1 1 1 / / / / / / _ / / f i / 1 i i / I i i / 1 i / 1 I / 1 / 1 f\ J S ~7-—---* V_ 10 100% B activity [pkat/ml] 2.0 1.0 20 V- [ mil Fig. 2. Chromatography of partially purified G6P-DII on a Mono Q column. Buffers: (A) 0.05 m sodium phosphate (pi 17.4); (B) same as A bul with I msodium chloride; flow-rate, I ml/min. Lines symbol as in Fig. I. Approximately 10 mg of protein were applied to the column. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE IQ 2 O Vpj [ ml ] FIGURE 3 Ionex chromatography of malate dehydrogenase on a Mono sorfc»ancz;e a"t 280 nm (Aj s o } I í -i-) ma— late dehydrogenase activity; -----,NaCl gradient ( buf ŕ c - 1.2 ml/min. CHROMATOFOKUSACE objem [ml] objem [ml] CHROMATOFOKUSACE Polybuffer (pulypufr) obsahuje ampholyty - směs látek majících různé pKa n xr J 1 T i T T objem CHROMATOFOKUSACE DĚJ NA KOLONĚ CHROMATOFOKUSACE CHOVÁNÍ VZORKU CHROMATOFOKUSACE CHOVÁNÍ VZORKU Použití: analytické - stanovení pi preparativní - purifikace bílkovin CHROMATOFOKUSACE Column: Mono P high performance column, 5 x ZOO mm (i.d. x bed height) Sample: Partially purified HIV-1 reverse transcriptase Start buffer: 25 mM ethanolamine, 10% glycerol. pH 9.4 Elution buffer: Polybuffer 96 (diluted 1:10). pH 6 Flow rate: 1 ml/min 8 12 16 20 24 28 Elution volume (ml) CHROMATOFOKUSACE 2SO ---e.o o.i Figure 6 CSiromatofocusirxg of the homogeneous DAO on Mono IP column ; ----F»H value of the eluate , flow—rate 0.7 ml/min, the other s3Tnbols as in F±&. 1. DAO activity is indicated "by an. arrow. GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE Princip - stérická exkluse - omezená d if use Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE 10 Totální exkluse KS 4 Selektivní permeace Totální permeace GELOVA PERMEACNJ CHROMATOGRAFIE Pharmacia LPC •Sephadex dextran •Sepharose agarosa •Sephacryl glukosa + akryamid •Sephacel cellulosa Pharmacia FPLC U SCI uperose uperdex asarosa sit'ovana asarosa a dextran sephadex -CHj hc— oh c- h OH h c-o m t * ■ 4 oh ch2 H cm- ÍO cm 300 cm krátká a silná kolona dlouhá a tenká kolona silná kolona nemá dostačující rozlišení ale má lepší průtok a kapacitu GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE ■ Nanášení vzorku objem vzorku < 2% objemu kolony ■ Eluce - izokratická Použití: stanovení Mr, odsolování, purifikace U SCI I GELOVA PERMEACNI CHROMATOGRAFIE i IOC 200 SCI Ve [ml ] Figure 3 Chromatography of partially purif ied dao on TSK 3000 SWG column. Buffer: 0.05 M potassiun phosphate (pH 6.5) with 0.15 M sodium chloride; flow rate 5 ml/min. The synbols are- as in Fi*c. 1 • DAO activity is indicated by an arrow. Approximately 100 mn of pro-rein were ajrplisd to the column. GELOVA PERMEACNJ CHROMATOGRAFIE O 50 100 150 200 Elution volume [ml] Figure 2. Chromatography of partially purified ICDH (after ammonium sulphate fractionation and ion exchange chromatography) on an UltroPac TSK G3000 SWG column. Buffer-20 mlVl sodium phosphate, pH 6.8; flow-rate 5mL/min. (Vc) elution volume; (-) v42«0; (-> ) ICDH activity. Approximately 1 O mg of protein was loaded onto the column. GELOVA PERMEACNJ CHROMATOGRAFIE 160 90 '-1-1- 4 4,5 5 5,5 log M Figure 3. Determination of relative molecular weight (Mw) of ICDH (•) by gel permeation chromatography on an UltroPac TSK 3000 SWG column. Vc elution volume; standards (O): catalase (240,000), aldolase (146,000), bovine serum albumin (67,000), ovoalbumin (43,000), chymotrypsinogen (25,000), and RNAse (13,700). AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE AFINITNÍ INTERAKCE Afin i trií intĽriíkfĽ specifický síahiíti i - komplex bílkovina - Ugand rererzihilní elektrostatické inlenikte polární hydroľobni van der Wsalsovy sily pnistorovŕ usponidúni vlastnosti prost ŕť d í INTERAKCE MEZI DNA A ENDONUKLEASOU Ligu rid Bílkovina KD (VI) antigen polyklonálni proti lálka 10*- 10-6 antigen monoklonální prolilätka 10"L2- 10"* biolin avidin 1015 saeharid lektin hormon, toxin vazebný protein ioJ'- iít12 substrát enzym 10"7- 10"3 inhibitor enzym 10 14 - 10^ AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE NANESENÍ VZORKU AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE VZNIK INTERAKCE AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE VYMYTÍ BALASTŮ AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE ELUCE PŘEDPOKLADY PRO VZNIK KOMPLEXU Sterické - použití raménka (spacer) 0 PŘEDPOKLADY PRO VZNIK KOMPLEXU ♦ ■ Konformační v* Vazebné ptimální pH, iontová síla STACIONÁRNÍ FÁZE • velké póry umožňuj ící průnik velkých molekul • co nej nižší nespecifické adsorpce • nejčastěji agarosa (Sepharosa) • Ugand kovalentně navázaný přes -OH skupinu cukerné jednotky nosiče PROVEDENÍ Nanesení vzorku - nízká iontová síla KD > 10-4 - slabá interakce KD < 106 ~ silná interakce obtížná eluce U l\l 1 SCI ELUCE Eluce - selektivní - volným ligandem nebo kompetičním činidlem ELUCE ■ Eluce - neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity ELUCE pulsní x gradientova LIG ANDY M o n os pec ifi c ké váží pouze jedinou biomakromolekulu nutné si připravovat individuálně Skupinově specifické •váží biomakromolekuly s podobnými vlastnostmi • komerčně dostupné latarlal MOBILIZACE LIGANDU Immobilized Affinity Ligand Techniques N-hydroxysukcinimid (NHS) -NH CNBr -NH (ill1!! T. Ili'iiiiiiiisiiii A. Krishna \h\11 in I'aiil k. Smilli Karbodiimid -NH2, -COOH Epoxid -SH, -NH2, -OH N-HYDROXYSUKCINIMID (NHS-SEPHAROSA) CNBR (CNBR AKTIVOVANÁ SEPHAROSA) N, N'-DISUBSTITUOVANÝ KARBODIIMID S e OH I a r o s e -0-CH2-CH-CH2-NH(CH2)^COOH ECH Sepharose S e R a r o s e OH i -0-CH2-CH-CH2-NH(CH2)£-NH2 EAH Sepharose EPOXID (EPOXY-AKTIVOVANÁ SEPHAROSA 6B) SKUPINOVÉ SPECIFICKÉ LIGANDY skupinově specifický ligand specifita Protein A Protein G Lektiny Cibacron Blue Procion Red Lysin Arginin Benzamidin Kalmodulin Heparin Streptavidin Oligo (dT, dA, ...) Fc region IgG Fc region IgG glukopyranosylové a mannopyranosylové skupiny široká skupina enzymů, NAD+ dependentní enzymy, sérový albumin NADP+ plasminogen, rRNA serinové proteasy serinové proteasy proteiny regulované kalmodulinem kolagulační faktory, lipoproteiny, lipasy, hormony, steroidní receptory, nukleové kyseliny vázající enzymy Biotin a biotinylované látky mRNA, nukleasy SKUPINOVÉ SPECIFICKÉ LIGANDY PROTEIN A A PROTEIN G protein A - Staphylococcus aureus protein G - Streptococcus purifikace: monoklonální protilátky IgG polyklonální protilátky IgG imunokomplexy Protein A Protein G Specie* Subclass binding binding Human IgA van able • IgD - - Ißt IgG, 4444 ♦+++ ejOg 4444 4444 HO, - 4444 IgG, lgM* 4+++ ♦44+ vanable - Chicken l8Y. - - Avian egg yak - - Cow ++ ♦444 I-,- ++ 4 Goat - 44 Guinea pig Hamster Horse IgG, Hfl. 4444 4444 + 44 44 44 4444 Koala 4 Llama - 4 Monkey (rhesus) 4444 4444 Mouse HB] + 4444 444+ 4444 +++ 4+4 Mi ++ 4-4+ I:M' vanable - PiR +++ 444 Rabbit no distinction ++++ 444 Rat IgG, - + lgG2. - 4444 1-'.. - 44 I«G, + 44 Sheep 44 skupinově specifické ligandy protein a a protein g Flow-through! Wash EE lute Volume (l_) Fig. 3. Chromatogram of affinity chromatography using ProSep-vA Ultra. Antibody fragment [F(ab)2] did not bind to ProSep-vA Ultra (fraction 0-1.4 1) and majority of the contaminants [ Fc fragment] that bound to the affinity matrix elutecl at pH 3.0 (fraction 1.8-4—2.IS 1). 0.O1 S O -1 O 20 30 -40 SO GO 70 IN/I i ri utos Fig. 5- HPLC analysis of purifiecl I-C alj )^ . Elutior) profile of FX d 1j as single Iioiiicjj;^* nous peak represents =>-E>S>5S purity of the product. Column: SEC. I SK Gel-3000 SWX.L C To sol-lass)- Sample: 20 u.1 of purifiecl F(ab)2 ; eluent: 20 mM p hos p ha te Ijuft'ei- In ISO mM sodium chloride solution. pH "7.2. Detection at 2 SO n m: now—rate: 1 m 1 m i n 1 . SKUPINOVÉ SPECIFICKÉ LIGANDY „DYE LIGAND" Procion™ Red (Red Sepharosa) K Ml,'- ■ NaO,S. _** ^ \- SO,Na OH N ■ OH N_/" 'SO-jNa Seplutose NAD+ NADP+ Dependentní dehydrogenasy Skupinově specifické Ugandy Cibacron Blue F4G-A A-OO 5 O O VR [ ml 1 FIGURE a Affinity chromatoK raphy o f maJ řxtce dehydrogenase from tJ . denitri f icans on Matrex Ger 1 Blue A < step 2 ) . V« , e 1 ut.i on -vo 1 ume ; .-- , absor-bance at 280 run ( Ai so); — - — , orizyino activity ;-----, NaCl í^radi ent < t>vj f f er- A. , O . 02 mol/l sodium phosphate ( j->I I 8. O) ; buffer J3 , the same as buf f er A fc>ut with 1.8 mol/1 NaCl and 5% ethylene Slyool > ; flow rate , app>ro:>c - O . V ml/min . SKUPINOVÉ SPECIFICKÉ LIGANDY LEKTINY Konkavalin A 'lektin z Canavalia ensiformis (jack bean) •tetramerní metalloprotein •větvené mannosidy, cukry s terminálni mannosou nebo glukosou (aMan > aGlc > GIcNAc) • purifikace glycoproteinů, polysacharidu a glykolipidú • detekce změn ve složení látek obsahujících cukry • isolace povrchových buněčných glykoproteinů „Lentil" lektin •lektin z Lens culinaris (čočka) •větvené mannosidy obsahující fukosu a-1,6 vázanou na N-acetyl glukosamin (aMan > aGlc > GIcNAc) •membránové glykoproteiny, povrchové buněčné antigény, virální glykoproteiny skupinově specifické ligandy CON A VOL (ml) FIG. 2. Step-elution profile of sciatic nerve protein from concanavalin A-agarose. Sciatic nerve protein was applied to a 0.9 x 20 cm column of concanavalin A-agarose and eluted with Con A buffer at a flow rate of 10 ml/h. When the AJBO of the effluent fell below 0.05, bound glycoproteins were desorbed with 50 mM-a-methylmannoside in Con A buffer. (Inset) Lane A: SDS elec-tfophoretic prottle ot proteins eluted in the wash peak (21 /xg protein); lane B. SDS electrophoretic profile of glycoproteins eluted by 50 mM-a-methylmannoside (12 ^.g protein). Arrowhead marks position of the sciatin band. Note the absence of this band in the wash peak (lane A). skupinově specifické ligandy CON A Activity pig ±j i< i-; i Oextran CF^is Oil I líc' <. > 1 I 1 I t 1 ethylene g 1 yo \ oliuiii.-;----- Partial puri Hcation of the crude preparation of the rabbit muscle LOi-f on Con ure l./V> or Blue Sepharose (Figure 1 . B > columns. Approximately 1.5 of" pr n. Buffers: A. = 20 mM Tris HCI B -= mM TTris HC1 (pH V .-4> with ol tlow rate — 0.05 ml/min during the loading of sample O.f* ml/min during, the e abst) i bance at 280 mil, - gradient Bi - . -*>—. — activity of I_f3 f—I . /N. Sepharo Dtci r\ -we re i řvi řsiaczri tution "V.. - applied and 3*?fo el ution skupinově specifické ligandy LEKTINY depicted Plasma sample 50 Trypsin digestion Lactoferrin (positive control) Invertase (negative control) GtycopeptKle stí O Glycopoptido standards spiked into plasma peptides and glycopeptides 4s v O Deglycosylatton using PNGaseF ♦ • » VVSQILHOaEIK tVW«VC«etMLI« F CMCNVTOL V A«3M< OShort wash with loading buffer O o f Flow-through fraction Elute bound fractior» with acetic acid FCMDNYTOL Ham Ý VYUŽITI AC PRO PURIFIKACI REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ fúzní kotva Glutathion S- transferasa GST Histidinová kotva His-tag Maltose Binding Protein MBP Protein A Green Fluorescent Protein GFP imobilizovaný ligand podmínky vazby redukovaný glutathion Chelatovaný nikl nebo kobalt Amylosa IgG Anti-GFP antibody Neutrální pH, nedenaturující prostředí, glutathion musí být redukovaný a GST musí být aktivní Neutrální pH bez redukčních a oxidačních látek Neutrální pH, nedenaturující prostředí; přídavek NaCI k snížení nespecifické sorbce Neutrální pH, nedenaturující prostředí Neutrální pH, nedenaturující prostředí podmínky eluce volný redukovaný glutathion >200 mM Imidazol. nízké pH. silné chelatační činidlo maltosa změna pH, iontové síly nízké pH, iontová síla Analytická afinitní chromatografie Analýza vazby ligandu na biopolymer má význam zejména pro posouzení vhodnosti nosiče se zakotveným afinantem z hlediska praktické použitelnosti. Hodnota K' se musí nacházet v intervalu (10-6 - 5.10-3) v jednotkách mol.ľ1. Vazba na imobilizovaný ligand bývá zpravidla slabší než na ligand volný. 1 / (VR - V0) = K' / (V0 - VM)* cL VM - mrtvý objem kolony V0 - el. objem nezadržovaného analog, biopolymeru (Mr) VR - eluční objem studovaného biopolymeru cL - koncentrace vázaného ligandu U SCI Analytická afinitní chromatografie Analýza vazby ligandu na biopolymer vychází z předpokladu, že oba ligandy (volný i zakotvený) se vážou na biopolymer kompetitivně (metoda kompetitivní eluce). Na kolonu obsahující nosič s vhodným afinantem naneseme biopolymer, k eluci použijeme určitou koncentraci kompetitivního ligandu (cL') a změříme eluční objem biopolymeru VR. Provedeme sérii pokusů s různými koncentracemi ligandu, získáme různé eluční objemy. 1 / (VR - V0) = K7 (V0 - VM)* cL' + [K'* c J / [(V0 - VM)*cL'* K] AFINITNÍ ULTRAFILTRACE niakromolekulární afinitní lisand O purifikovaná bílkovina O balastní bílkovina O o o o inkubace * * * promyvani eluce AFINITNI ULTRAFILTRACE v - si j e č n ý bílek zředěn V v p o m ěrn 1:8 O.l Tví NaH:PG4 pH ÍO I li o in ogeuiznrc (specifická aktivita 3 413 j/mg pioteimi) ulrrsifiltr.ice :nt off limit membrány 300 OOO 11* e t e li si t I permeit (sp. akt. 17 14-9 j/mg proteinu iukiibace s c li i t o s a n e in 6O niiiitit při 2 4 "C a f i ii i t ii í ultrnfiltrace »jpermf át j cnt off limit membrány 3 00 OOO l pro in yti O.l JVl NaH^PO^ pH ÍO 3 x e 1 n c e 0. 1 >s.1 kyselina octová produkt sp. Aktivita -1. -47 386 j/mg 1. 1 06 497 j/mg 3. 121 094 j/mg AFINITNÍ PRECIPITACE AFINITNÍ PRECIPITACE AFINITNI PRECIPITACE ox I iver (46 g]J) rat liver (10g) ^) C homogenize for 1 rninin 10 vol urn es (wiv] of 4rnM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.5 mM EDTAand 0.1 mM PMSF Stage 1 (hornogenate) add (NH^]2S04 (113 g/liter), stir for 20 min centrifuge and discard pellet ad d (NH 4)2 so4 (188 g/lit er), stir f or 2 0 mi n centrifuge and discard pellet ^ dialyze against 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 ^ Stage 2 [ dialyze d (NhMteSOi pellet] Stage 3 (DEAE eluatel c apply to DEAE-cellulose column elute vith 20 to 200 mM sodium phosphate, pH 7.4, gradient and concentrate to~10rnl affinity precipitate vith the appropriate amount determined from pilot precipitation experiment (Support Protocol 9) of bis-NAD+ in the presence of 79 mM glutaric acid and keep on ice overnight centrifuge 1 r discard supernatant c redissolve pellet by stirring for 6 hr in 1 ml of buffer containing 0.6 mM NADH J Stage 4 (purified enzyme) dialyze against 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 c purified glutamate dehydrogenase D AFINITNÍ PRECIPITACE Table 1.4.7 Purification of Glutamate Dehydrogenase From Ox Liver According to Alternate Protocol 1 Stage (see Volume Total protein Total activity Specitic activity Purification Yield Fig. 1.4.4) (ml) (mgf (umol/min) (umol/min/mg) (v-fold) (%) 1 370 8580 1920 0.2 1 100 2 75 2010 1640 0.3 4 86 3 8.4 139 408 2.9 13 21 4 1.2 9.4 376 40 180 20 "Protein eonce titration determined by the Lowry method. Table 1.4.8 Purification of Glutamate Dehydrogenase From Rat Liver According to Alternate Protocol 1 Stage (see Volume Total protein Total activity Specific activity Purification Yield Fig. 1.4.4) (ml) (mg)fl (umol/min) (umol/min/mg) (A-fold) (%) 1 90 2720 760 0.3 1 100 2 35 980 505 0.5 2 67 3 9.8 130 195 1.5 5 26 4 1.0 9.4 190 37 140 25 ^Protein concentration determined by the Lowry method. AFINITNÍ PRECIPITACE konjugát Kg-and-polymer separovaná bílkovina rozpustný vazba regenerace t konjugal ligand-polymer nerozpustný komplex bílkovina - ligand-polymer rozpustný precipitace e luce komplex buč o vina - ligand-po lynx; r nerozpustný AFINITNÍ PRECIPITACE yeast cells high pressure homagenization cell homogenate I ftoccttlation of cell debris with 0.25 PEJ cell extract Incubate with 03% Eudragit-Cibacron blue and 1 .5 mM zink sulfate, pH 7.5 for 10 min. at 20 *C. Add 50 mM calcium chloride and incubate at 40 °Cfor 5-10 min. Precipitation of Eudragit bound affinity complex 60% recovery 20 x enrichment U IM ] s n t ADH in solution Desorption of ADH with 200 mM iminodiacetic acid, pH 75, 4 °C. Add 50 mM calcium chloride and incubate at 40 °C for 5-10 min. Recycle Precipitate of Eudragit-dye HISTORIE CHROMATOGRAFIE ■ 1906 Tswett(Cvět) Poprvé použit pojem chromatografie, chromatogram z řeckých slov chromá (barva) a grafein (psáti). ■ 1931 Kuhn a Lederer znovu objevení chromatografie ■ 1940-49 Martin Synge Papírová a tenkovrstvá chromatografie ■ 1950-1960 Sober, Peterson a Gutter zavedli používání médií na bázi celulosy (iontoměniče) SCI HISTORIE CHROMATOGRAFIE ■ 1950 Aminokyselinový analyzátor ■ 1959 Porath a Flodin poprvé použili média na bázi dextranu pro gelovou filtraci. ■ 1962 Hjerten popsal použití separačních médií na bázi agarosy. ■ 1970-79 Halasz, Horvath, Kirkland HPLC ("High Performance Liquid Chromatography") MUNI SCI HISTORIE CHROMATOGRAFIE ■ 1980-1989 Pharmacia Nová média s vyšší mechanickou odolností ( CL-agarosa, "cross-linked") umožňují použití vyšších tlaků pro separaci; nový střednětlaký systém "Fast Protein Liquid Chromatography" (FPLC) ■ 2004 Waters UPLC ("Ultra Performance Liquid Chromatography") MUNI SCI