CHROMATOGRAFICKÉ METODY II. APLIKAČNÍ ROZSAH CHROMATOGRAFIE PC a TLC  1944 – Martin, Synge PC aminokyselin (Nobelova cena)  1952 – TLC nahrazuje PC INSTRUMENTACE PC a TLC CHROMATOGRAFICKÝ PAPÍR  Nemodifikovaný  Modifikovaný – ionexy, acylace f. Whatman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo) TLC  Vlastní příprava - sypané, nalévané  Komerčně dostupné - Silufol (ČR) Whatman PC a TLC - MODY  rozdělovací  adsorpční  ionexová  hydrofobní – RP a HIC  gelová permeační NANÁŠENÍ VZORKU  Pipety  Kapiláry PROVEDENÍ  Vzestupné  Sestupné  Kruhové  Dvojrozměrné VZESTUPNÉ SESTUPNÉ KRUHOVÉ VYVÍJENÍ DVOJROZMĚRNÉ PROVEDENÍ  Analytické  Preparativní DETEKCE  Fyzikální  UV VIS  Fluorescence  Chemická – derivatizacce  Specifická  Nespecifická  Na základě biologické aktivity ANALÝZA KVALITATIVNÍ standardy vzorky larozpouštěd čelo skvrny střed fR  vzdálenost čela mobilní fáze od startu (dm) vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu (di) ANALÝZA KVANTITATIVNÍ  Planimetrie  Denzitometrie Plocha skvrn DENZITOMETRIE PREPARACE  PC – vystřižení a eluce skvrny  TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny KOLONOVÁ CHROMATOGRAFIE KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ  Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC  Střednětlaká (4 MPa) – FPLC  Vysokotlaká (40 MPa) – HPLC  Ultravysokotlaká (100 MPa) – UPLC KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE VYUŽITÍ DOBA TRVÁNÍ  LPC – preparativní  FPLC – semipreparativní a analytická  HPLC – analytická  UPLC – analytická hodiny desítky minut minuty sekundy ZAŘÍZENÍ PRO LPC ZAŘÍZENÍ PRO LPC ZAŘÍZENÍ PRO LPC INSTRUMENTACE PRO LPC  Pumpa – peristaltická nebo gravitace  Gradient – mísič gradientu  Dávkování – přímo pumpou na kolonu  Kolony – skleněné  Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm  Vyhodnocování – zapisovač  Sběrač frakcí – programovatelný ZAŘÍZENÍ PRO LPC LPC INSTRUMENTACE PRO FPLC A HPLC ZAŘÍZENÍ PRO FPLC A HPLC ZAŘÍZENÍ PRO FPLC ZAŘÍZENÍ PRO HPLC ZAŘÍZENÍ PRO UPLC UPLC X HPLC • kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita) • snížení nákladů = menší spotřeba HPLC rozpouštědel (ekologie) • zvýšení separační účinnosti • snížení meze detekce – zvýšení citlivosti • více kvalitativních informací UPLC X HPLC UPLC X HPLC PŘÍPRAVA MOBILNÍ FÁZE PŘÍPRAVA MOBILNÍ FÁZE • filtrace ODPLYNĚNÍ MOBILNÍ FÁZE •přechod varem za nízkého tlaku •ozvučení ultrazvukem •vakuová filtrace •in-line membránové odplynění •probublávání inertním plynem PUMPY PUMPY PRACUJÍCÍ ZA KONSTANTNÍHO TLAKU TLAKOVÁ PUMPA PUMPY PRACUJÍCÍ ZA KONSTANTNÍHO PRŮTOKU LINEÁRNÍ DÁVKOVAČE PUMPA JEDNOPÍSTOVÁ PUMPA DVOUPÍSTOVÁ PUMPA DVOUPÍSTOVÁ PUMPA DVOUPÍSTOVÁ TLUMENÍ PULSŮ TLUMENÍ PULSŮ GRADIENT NÍZKOTLAKÝ GRADIENT VYSOKOTLAKÝ DÁVKOVÁNÍ – SEPTUM DÁVKOVÁNÍ DÁVKOVACÍ VENTIL DÁVKOVACÍ VENTIL – „LOAD“ DÁVKOVACÍ VENTIL – „INJECT“ KOLONY PRO FPLC KOLONA 1. kovový plášť 2. porézní kovová frita 3. stacionární fáze 4. převlečný ochranný kroužek 5. koncová hlavice 6. vstup pro kapiláru se šroubem PŘEDKOLONA KOLONY PRO HPLC A UPLC KOLONY PRO NANO- A KAPILÁRNÍ HPLC ČÁSTICOVÝ SORBENT tvar: sférický (bez povrchových vad) rozměr pro kolony: analytické 1 – 8 μm preparativní > 10 μm povrchové rozrůznění póry polymerní částice MONOLITICKÝ SORBENT makropóry: ~1500 nm; mezopóry: < 50 nm, mikropóry < 2 nm pórovitost monolitické stacionární fáze až 85 %; oproti částicové s pórovitostí max 60 % vysoké průtoky za nízkých tlaků;  velká efektivní plocha  rychlá separace:  vysoké rozlišení a vysoká kapacita ML‐SF na bázi siliky tetramethoxysilan (TMOS) tetraethoxysilan (TEOS) + kyselina octová + polyethylenglykol (PEG) ML‐SF na bázi organických materiálů styren-divinylbenzen (S-DVB) izooktan metakryláty tetrahydrofuran vinyl-deriváty (vinylpyrrolidon, vinylacetát) dekanol monomer + polymerační činidlo + porogen provedení: disk, trubička, plněná kapilára nevýhoda: obtížná výroba PERFÚZNÍ CHROMATOGRAFIE  Využívá médií - POROS média, jejichž částice (10, 20,50 m) mají velké příčné póry - 600 - 800 nm. Molekuly biopolymerů unášené konvektivním prouděním mobilní fáze se těmito póry lehce dostávají do nitra částic. Příčné póry jsou navíc vzájemně propojeny krátkými “difuzními” póry - 50–150 nm. Vytváří se tak síťová struktura s rozsáhlým vnitřním prostorem pro interakci nosiče s biopolymerem.  PERFÚZNÍ CHROMATOGRAFIE - PRINCIP Průtokem mobilní fáze vytváří napříč každou částicí média rozdíl tlaku, který indukuje konvektivní tok příčnými póry (perfúze). Biomakromolekuly ve vzorku se tak dostávají do kontaktu jak s povrchem částic, tak i s vazebnými místy v jejich nitru. PERFÚZNÍ CHROMATOGRAFIE K efektu perfúze dochází jen při určité průtokové rychlosti. Moderní HPLC a FPLC systémy mohou zajistit podmínky perfúze pouze u malých analytických POROS kolon (4.6 x 100 mm, objem 1.7 ml, při průtokové rychlosti kolem 10 ml.min-1).  Výhody ve srovnání s chromatografií konvenční:  Kapacita je vysoká, nezávisí na průtokové rychlosti.  Rozlišení je vysoké, nezávisí na průtokové rychlosti.  Rychlost separace je obvykle 10 - 100x větší než u konvenčních médií, řádově se pohybuje v minutách. PERFÚZNÍ CHROMATOGRAFIE - PRINCIP UPLC stacionární fáze Waters UPLC stacionární fáze Waters CHIPOVÁ CHROMATOGRAFIE struktury vyleptané do křemíkové (Si) destičky výhody: rychlost analýzy, velikost, malá spotřeba vzorku (< nl !) nevýhody: práce s malými objemy (povr. napětí, elektrostatické interakce) pohyb MF: pumpa, odstředivá síla, elektrostaticky CHIPOVÁ CHROMATOGRAFIE AGILENT DETEKTORY DETEKTORY REFRAKTOMETRICKÝ DETEKTOR index lomu šum 10-7 dyn. rozsah 104 citlivost 10-7 g/ml REFRAKTOMETRICKÝ DETEKTOR REFRAKTOMETRICKÝ DETEKTOR „LIGHT SCATTERING“ DETEKTOR Rozptyl šum 10-8 dyn. rozsah 104 citlivost 10-9 g/ml UV – VIS DETEKTOR DETEKČNÍ CELA Absorbance šum 10-4 dyn. rozsah 104 citlivost 10-10 g/ml UV – VIS DETEKTOR S FIXNÍ VLNOVOU DÉLKOU UV – VIS DETEKTOR S PROMĚNLIVOU VLNOVOU DÉLKOU UV – VIS DETEKTOR S DIODOVÝM POLEM FLUORESCENČNÍ DETEKTOR Fluorescence citlivost 10-9 g/ml ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR elektrický proud citlivost 10-9 g/ml KONDUKTOMETRICKÝ DETEKTOR Vodivost šum 10-3 dyn. rozsah 106 citlivost 10-8 g/ml AEROSOLOVÝ DETEKTOR NABITÝCH ČÁSTIC LC-MS počet iontů citlivost 10-13 g/ml „ELECTROSPRAY“ IONIZACE ANALYZÁTOR ION TRAP KVADRUPOL ŠUM A DRIFT DETEKTORU Mez detekce S/N > 3 Mez stanovitelnosti S/N > 10 > 3 LINEÁRNÍ ROZSAH DETEKTORU DERIVATIZACE  zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec  zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec  zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně POŽADAVKY NA DERIVÁTY  chemické individuum  stabilní  reakce kvantitativní, rychlá, selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (pH, teplota)  činidlo musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně jiné fyzikálně-chemické vlastnosti DERIVATIZACE  „pre-column“ - před vlastní analýzou  „post-column“ – za kolonou po analýze DERIVATIZACE VYHODNOCENÍ Zapisovače Integratory Integrační software + PC HISTORIE KVANTIFIKACE Zjištění plochy píků u zapisovačů vážením Zjištění plochy píků u zapisovačů planimetrem Zjištění plochy píků u zapisovačů výpočtem plocha = základna x výška INTEGRATOR PROVEDENÍ Analytické Preparativní ANALÝZA KVALITATIVNÍ  Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů  „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků  Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická  MS ANALÝZA KVANTITATIVNÍ  Plocha (výška) píku ANALÝZA KVANTITATIVNÍ  Metoda vnitřního standardu ANALÝZA KVANTITATIVNÍ  Metoda standardního přídavku PROBLÉMY PŘI LC ANALÝZE LC ANALÝZA