ELEKTROMIGRAČNÍ METODY LITERATURA HISTORIE ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD  1806 Reuss Elektroforéza – pohyb koloidní částic v elektrickém poli  1897 Kohlrausch regulační funkce  1930 Arne Tiselius Volná a zónová elektroforéza (1948 Nobelova cena)  1962 Vesterberg, (Svensson) Rilbe izoelektrická fokusace  1967 Hjerten kapilární elektroforéza v rotující 1 - 3 mm křemenné kapiláře HISTORIE ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD  1970 Laemmli SDS PAGE  1975 O´Farrell 2D-elektroforéza  1976 Everaerts, Mikkers isotachoforéza  2003 Karger Multikapilární CE – lidský genom FREDERIC REUSS (1807) KATOFORÉZA FRIEDRICH KOHLRAUSCH (1874) REGULAČNÍ FUNKCE x i i K cz i z   PODSTATA „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“ MOBILITA + Fe Ff- + E Teoretické aspekty elektromigračních metod QEFe  E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = zi  e [] ELEKTRICKÁ SÍLA Fe FRIKČNÍ SÍLA Ff fvFf  v = rychlost částice f(frikční koeficient) = 6..r Teoretické aspekty elektromigračních metod [m2 V-1 s-1] E Q v f   v E Q f   f Q E v  Ustálený stav mobilita Teoretické aspekty elektromigračních metod IONTOVÁ MOBILITA (LIMITNÍ ZŘEDĚNÍ, TEPLOTA 298 K) KATIONTY 0.109 ANIONTY 0.109 H3O+ Li+ Na+ K+ Tris+ alanin ethanolamin imidazol 362.5 40.1 51.9 76.2 29.5 36.7 44.3 52.0 OH- F- Cl- NO3 - SO4 - k.mléčná k.octová MES 205.5 57.4 79.1 74.1 82.9 36.5 42.4 28.0 EFEKTIVNÍ MOBILITA    k i ii k i ii A A xc c 00 1  A0,A1,A2,........Ak 0,1,2,...........k cA = celková analytická koncentrace látky A xi = molární zlomek iontu i ZÁVISLOST EFEKTIVNÍ MOBILITY NA pH  pro slabou monovalentní kyselinu  pro slabou monovalentní zásadu     A HA A HK H           BH BH B HK H       ZÁVISLOST EFEKTIVNÍ MOBILITY NA pH pro slabou monovalentní zásadu     A HA A HK H           BH BH B HK H       ZÁVISLOST EFEKTIVNÍ MOBILITY NA pH pro slabou monovalentní kyselinu ZÁVISLOST EFEKTIVNÍ MOBILITY NA pH pro bílkovinu VLIV VELIKOSTI MOLEKULY NA MOBILITU f Q  r Q ..6     - viskozita prostředí r – poloměr částice 3 2 3 11   rM r VLIV IONTOVÉ SÍLY NA MOBILITU          o o czz z I I ( . . )0 23 313 10 1 9 z = náboj iontu zc = náboj protiiontu I – iontová síla VLIV TEPLOTY NA MOBILITU )](02.01[ oTT ToT  To = standardní teplota T = pracovní teplota SEKUNDÁRNÍ JEVY  Jouleovo teplo  Elektroosmóza  Difuze JOULEOVO TEPLO P E i S i S     2 2 P = výkon [W.m-3] S = průřez [m2]  = vodivost [-1.m-1] i = elektrický proud [A] ELEKTROOSMOTICKÝ TOK ELEKTROOSMOTICKÝ TOK     4 eo v Eeo      4  = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy  = viskozita  = dielektrická konstanta eo = elektroosmotická mobilita PŮVOD ELEKTROOSMOTICKÉHO TOKU ELEKTROOSMOTICKÝ TOK Laminární tokEOF ELEKTROOSMOTICKÝ TOK V RŮZNÝCH KAPILÁRÁCH DIFUZE )( 0 2 2  x ecc   Dt2 2 = rozptyl D = difuzní koeficient DIFUZE ELEKTROFORÉZA „Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“ ELEKTROFORÉZA  Volná  Zónová A+B C B+C A+B+CA+B+C A A > B >C + +- - VOLNÁ ELEKTROFORÉZA ARNE TISELIUS (1902 –1971) VOLNÁ ELEKTROFORÉZA ARNE TISELIUS Nobelova cena 1948 ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA + + A+B+C A B C - -A > B >C STABILIZACE  Rotací  Gradienty hustoty  Porézními medii  Kapilárou STABILIZACE Gradienty hustoty POŽADAVKY NA PORÉZNÍ MEDIA  Homogenita  Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF  Reprodukovatelná a snadná příprava  Mechanická pevnost  Transparentnost PORÉZNÍ MEDIA 1939 Papír 1950 Agarový gel 1955 Škrobový gel 1957 Acetát celulosy 1959 Polyacrylamidový gel 1979 Agarosový gel CHROMATOGRAFICKÝ PAPÍR Složení – celulosa - Nehomogenní - Přítomnost ionogenních skupin - Špatně se chladí – pálí se Použití : téměř už se nepoužívá CHROMATOGRAFICKÝ PAPÍR CHROMATOGRAFICKÝ PAPÍR ACETÁT CELULOSY Složení – acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití : imunoelektroforetické metody, klinické aplikace ACETÁT CELULOSY ACETÁT CELULOSY ACETÁT CELULOSY ANALÝZA SÉROVÝCH BÍLKOVIN ACETÁT CELULOSY HEMOGLOBINU HPFH – dědičné přetrvávání hemoglobinu F (“hereditary persistence”) pH 8.4 1. Normální dospělý 2. HPFH (heterozygot) 3. Hb S--HPFH 4. Hb C--HPFH 5. Normální novorozenec Hemoglobin S a C – mutace v primárni struktuře, náhrada jedné z aminokyselin za druhou. AGAR A AGAROSA Složení – kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK AGAR A AGAROSA AGAR A AGAROSA AGAR A AGAROSA DNA AGAROSOVÁ ELEKTROFORÉZA Ethidiumbromid ‐ červeň, která v roztoku fluoreskuje pouze slabě, intenzita fluorescence se výrazně zvyšuje vazbou na DNA interkalací mezi páry bazí. Excitace při 302 nm, červeno‐ oranžová emise při 510 nm. Velmi toxická látka! PULSNÍ DNA ELEKTROFORÉZA 20 000 – 12 000 000 PB PULSNÍ DNA ELEKTROFORÉZA 20 000 – 12 000 000 PB PULSNÍ DNA ELEKTROFORÉZA 20 000 – 12 000 000 PB IMUNOELEKTROFORÉZA ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA + DIFUZE IMUNOELEKTROFORÉZA RAKETOVÁ ŠKROB Složení – hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta - Špatné mechanické vlastnosti - Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava - Není transparentní Použití : izoenzymová analýza SYPANÉ VRSTVY Složení – Sephadex – zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní POLYAKRYLAMID Složení – kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin a NK POLYAKRYLAMID ‐ PŘÍPRAVA Radikálová polymerace  Katalyzátor – tetramethylethylendiamin (TEMED)  Iniciátor - chemicky – (NH4)2S2O8 - fotochemicky – ribloflavin + UV POLYAKRYLAMID - SLOŽENÍ %100   m ba T %100   ba b C a – akrylamid (g) b – methylenbisakrylamid (g) m – objem (ml) FERGUSONOVA ROVNICE PAGE není pouze pasivním nosičem, ale podílí se na separaci efektem molekulového síta.  TKr 0loglog   - mobilita 0- mobilita při limitním zředění Kr – retardační koeficient T  T  T A B MrA= MrB pIA pIB UPLATNĚNÍ FERGUSONOVY ROVNICE A B MrA  MrB pIA pIB MrA  MrB pIA= pIB A B PROVEDENÍ PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientové kontinuální x diskontinuální nativní x SDS PAGE USPOŘÁDÁNÍ Horizontální + - + - Vertikální PROVEDENÍ PAGE deskové x trubičkové PROVEDENÍ PAGE deskové x trubičkové PROVEDENÍ PAGE deskové x trubičkové PROVEDENÍ PAGE PROVEDENÍ PAGE deskové x trubičkové PROVEDENÍ PAGE homogenní x gradientové PROVEDENÍ PAGE homogenní x gradientové PROVEDENÍ PAGE homogenní x gradientové PROVEDENÍ PAGE kontinuální x diskontinuální DISKONTINUÁLNÍ PAGE ORSTEIN, DAVIS Koncentrační gel T = 3 – 5 % Separační gel T = x % Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Koncetrační pufr Tris HCl pH 6.8 Separační pufr Tris Glycin pH 8.3 Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Cl-GlyB- A- Cl-GlyB- ASeparační gel Zónová elektroforéza Koncentrační gel Izotachoforéza + - DISKONTINUÁLNÍ PAGE ORSTEIN, DAVIS SDS PAGE OSO3 -Na+ + -- - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS  uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE STANOVENÍ Mr POMOCÍ SDS PAGE Log Mr Rm čelo skvrna Rm  STANOVENÍ MR POMOCÍ SDS PAGE - STANDARDY POUŽITÍ SDS PAGE  Stanovení Mr  Analýza komplexních směsí  Sledování purifikace bílkovin  Stanovení podjednotkového složení + - + - + - STANOVENÍ Mr POMOCÍ SDS REDUKUJICÍ X NEREDUKUJÍCÍ PAGE - SEKVENACE DNA CHEMICKÁ METODA BÁZE CHEMIKÁLIE G dimethylsufoxid+ piperidin G + A dimethylsufoxid+ piperidin + k.mravenčí C hydrazin/chlorid sodný+ piperidin C + T hydrazin + piperidin ENZYMOVÁ METODA PREPARATIVNÍ PAGE AUTOMATIZACE PAGE FAST-SYSTEM