Biotechnologické procesy Dnes o živočišných buňkách, potažmo pak o skupině živočišných buněk, kterým říkáme kmenovéh buňky Blok IV. Vladimír Rotrekl @ 2020 Biotechnologické procesy: Živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky: Sylabus 1) Úvod do živočišných buněk a jejich specifik, potence a diferenciace, Hayflickuv limit, imortalizované linie, kultivace a jejich diferenciace (včetně large scale, GMP a industry grade) 2) Použití živočišných buněk k výrobě léčiv, použití živočišných, potažmo kmenových buněk ve screeningu a výrobě léčiv 3) Živočišné buňky a buněčná terapie, kde končí transplantace a začíná biotechnologie, metody, příklady, požadavky SUKL/EMA na jejich výrobu a použití 4) Speciální aplikace a výhled do budoucna (3D kultivace, Organoidy, 3D tisk buněk, in vitro tvorba náhražek tkání a orgánů, genová ) Vladimír Rotrekl @ 2020 Harane; Cells 2023 .. https://doi.org/10.3390%2Fcells12071001 Další zdroje buněk pro organoidy: …Sferoidy a organoidy z nádorových kultur Primarní nádorové buňky nebo nádorové linie ve smíšené kultuře s kmenovými buňkami (pluripotentními/mezenchymálními/tkáňově specifickými): Nádorové buňky nastavují mikroporostředí pro kmenové buňky a někdy umožňují diferenciaci a uspořádání organoidu bez použití růstových faktorů a dodaných proteinů/peptidů extracelulární hmoty (ECM).. Výhody: • zralý fenotyp • snížená potřeba dodávání ECM a růstových faktorů Nevýhody: • Stejné jako nádorové linie (viz blok I.) Další zdroje buněk pro organoidy: …Sferoidy a organoidy z mezenchymálních KB Sferoidy z mezenchymalnich kmenovych buněk (MSC) vyrobene akustickou vlnou Fibrin + médium Jeger-Madiot; Sci Rep 2021.. https://doi.org/10.1038/s41598-021-87459-6 Organoidy – dodatek (z čeho a jak systematicky..) Kim a kol. Nature Reviews, 2020 https://doi.org/10.1002%2Fsctm.19-0286 Organoidy a transplantace -limit velikosti: vaskularizace Nedostatečná pasivní difuze kyslíku Velké množství buněk, absence perfuze + Masivní vrstva extracelulární hmoty Transplantace zahrnuje většinou 106-108 buněk…. Proto snaha získat velké organoidy ALE !!! Vaskularizace/perfuze organoidů: • Bioprinting • Digital micro mirror (DMD) patterning • Direct 2 foton fabrication • Sacrifical networks • Substractive fabrication by lased ablation • Tvorba matrice s proangiogenní aktivitou • Induced angiogenesis in engeneered tissue • Organoid Vascularization via in vivo Organoid Transplantation K tomu všemu většinou potřebujeme microfluidiku Organoidy a transplantace -limit velikosti: vaskularizace …jinými slovy snažíme se vytvořit „cévní“ systém Mikrofludika Hu et al., 2014 Využití toku živného roztoku, nebo média mikroskopickými kanály (velikostně srovnatelnými s velikostí buněk) Mimicking the life.. Size matters.. Mikrofludika Metody přípravy mikrofluidních systémů: Biotisk Litografie Odstranění formy Laserové aplikace Mechanická výroba Spontánní angiogeneze in vivo nebo in vitro Yu et al. Micromachines, 2019 „Primitivní“ mikrofluidní systém zajišťující perfuzi mnoha malých jaterních organoidů (v podstatě srovnatelné s bioreaktory) Mikrofludika Od mikrofluidních systémů čekáme: Využití toku živného roztoku, nebo média mikroskopickými kanály (velikostně srovnatelnými s velikostí buněk ELVESYS Evelflow Řízené ventily používané v mikrofluidních systémech: (často používaný materiál PDMS (Polydimethylsiloxane)) Mikrofludika Od mikrofluidních systémů čekáme: Využití toku živného roztoku, nebo média mikroskopickými kanály (velikostně srovnatelnými s velikostí buněk Potřebujeme: Schopnost regulace toku (jiné požadavky např. pro motorické neurony a střevní epitel) Yu et al. Micromachines, 2019 Mikrofludika: čipy Od mikrofluidních systémů čekáme: Využití toku živného roztoku, nebo média mikroskopickými kanály (velikostně srovnatelnými s velikostí buněk) Potřebujeme: Schopnost regulace toku (jiné požadavky např. pro motorické neurony a střevní epitel) Př. Nikotin ovlivňuje růst axonů mozkového organoidu Přenosná 3-D tiskárna „kůže“ Hakimi, Lab on a Chip, 2018 • Mikrofluidní tisk vrstvy směsi bioinkoustu (např alginát, fibrin, kolagen, hyaluronát) a kožních buněk (keratinocyty) • Následuje rychlý kroslinking: krycí vrstva kroslinkeru – trombin při tisku fibrinu, 10mM NaCl pro alginát atd.. Biokompatibilní nosiče jsou důležité pro funkce buněk v uměle vytvořených orgánech Umělé (chemické) nosiče a kmenové buňky + Neomezené zdroje - Pouze “jednoduché” aplikace - Absence bioaktivních molekul a induktivních signálů Biologické bezbuněčné nosiče a zdravé funkční buňky - Limitace podobné jako s orgány + Klinicky použitelné Lidské orgány ve zvířatech + Perspektivní - Legislativní a etické bariéry - Nejasná biologie Biokompatibilní nosiče jsou důležité pro funkce buněk v uměle vytvořených orgánech Umělé (chemické) nosiče a kmenové buňky + Neomezené zdroje - Pouze “jednoduché” aplikace - Absence bioaktivních molekul a induktivních signálů Biologické bezbuněčné nosiče a zdravé funkční buňky - Limitace podobné jako s orgány + Klinicky použitelné 3D kultivace tkáňových kultur: kultivační nosiče (scafoldy) 3-D tisk: ..viz Biotechnologické procesy: živočišné tkáňové kultury, blok III Decelularizovaná tkáň/orgán: Decelularizace: většinou pufrované roztoky obsahující silné detergenty (např. 1% Triton, 1% SDS) – rozpustí membrány a perfuze vymyje obsah Perfuze orgánu – základ decelularizace Blum, Technological Advances in Organ Transplantation, 2018 1) Orgánová lázeň 2) Temperovací okruh 3) Teplotní čidlo 4) Peristaltická pumpa 5) Kontroler tlaku orgán Hlavní zásobovací tepna Decelularizace mezibuněčné hmoty 1) Orgánová lázeň 2) Temperovací okruh 3) Teplotní čidlo 4) Peristaltická pumpa 5) Kontroler tlaku Zia a kol., Critical Reviews in Biotechnology, 2015 SDS Triton Tok Tok Kolagen, Laminin, Fibrin atd (detergent neublíží) Decelularizace mezibuněčné hmoty Zia a kol., Critical Reviews in Biotechnology, 2015 SDS Triton Tok Tok Kolagen, Laminin, Fibrin atd (detergent neublíží) Repopulace orgánu s použitím buněk z tkáňové kultury Tvorba lidského srdce z kmenových buněk na scafold od dárce Umělé srdce dočasné řešení před transplantací Tvorba lidského srdce z kmenových buněk na scafold od dárce Umělé srdce dočasné řešení před transplantací Lidské srdce nepoužitelné k transplantaci Zvířecí podobné velikosti a funkce Ott et al., Circulation Research, 2008 Decelularizace lidského srdce Tvorba lidského srdce z kmenových buněk na scafold od dárce Lidské srdce nepoužitelné k transplantaci Repopulace decelularizovaného srdce Ott et al., Circulation Research, 2008 500 mil. srdečních buněkLidské indukované pluripotentní buňky Při elektrické stimulaci viditelné kontrakce (..až 139mm Hg) Tvorba lidského srdce z kmenových buněk na scafold od dárce Decelularizace lidského srdce Lidské srdce nepoužitelné k transplantaci Diferenciace “Umělá” plíce za použití kmenových buněk a diferenciace in vitro …a dočasná podpora dýchání Mimotělní membránový oxygenátor Management selhání plic: - Dočasná mimotělní oxygenace - Transplantace plic …nebo vypěstovat nové plíce “Umělá” plíce za použití kmenových buněk a diferenciace in vitro …a dočasná podpora dýchání …nebo vypěstovat nové plíce T.H.Petersenetal.,Science329,538-541(2010) Fig. 1 Schema for lung tissue engineering Repopulace bezbuněčné plicní matrix plicními buňkami a implantace funkčních plic do experimentálního zvířete …nebo vypěstovat nové plíce Rozpěstovaná směsná primokultura in vitro Cévní epitel Plicní epitel decelularizované plíce T.H.Petersenetal.,Science329,538-541(2010) Fig. 1 Schema for lung tissue engineering Repopulace bezbuněčné plicní matrix plicními buňkami a implantace funkčních plic do experimentálního zvířete …nebo vypěstovat nové plíce Rozpěstovaná směsná primokultura in vitro Cévní epitel Plicní epitel decelularizované plíce T.H.Petersenetal.,Science329,538-541(2010) Fig. 1 Schema for lung tissue engineering Repopulace bezbuněčné plicní matrix plicními buňkami a implantace funkčních plic do experimentálního zvířete In vivo: 45-120 minut participovaly na výměně kyslíku …nebo vypěstovat nové plíce Rozpěstovaná směsná primokultura in vitro Cévní epitel Plicní epitel decelularizované plíce Játra Plíce (repopulace primokulturou z E14 plic) Bonandrini, Tissue Engeneering, 2014 bez funkční odezvy Decelularizované scafoldy + repopulace: další orgány.. Srdce Ledviny (repopulace mESC) Zubní lékařství příští generace? Epiteliální kmenové buňky Mezenchymální kmenové buňky Hydrogel Buněčné kultury Orgánové kultury Transplantace “Dospělé” kmenové buňky & orgánové kultury Pluripotentní kmenové buňky & syntetické nosiče Diferenciace buněk nervové lišty, odontogenních a osteogenních buněk Klinicke zkoušky buněčných produktů nemají na růžích ustláno… … nebo mají? Léky/léčebné zákroky obsahující kmenové buňky Upraveno Evropskou lékařskou agenturou (EMA) evropskou směrnicí Regulation (EC) No 1394/2007: Závazné pro jakýkoliv lék, léčebnou metodu, která zahrnuje: • více, než minimální manipulaci jakéhokoliv buněčného typu určeného ke klinické aplikaci • Zamýšlené použití buněk se liší od jejich normální funkce v těle 2009 Klinicke zkousky (I. Fáze) pouze 4 pacienti s poraněním míchy (původně plánováno 8) 7- 14 dní po poranění 2011 Geron předčasně zkoušky ukončil – výsledek: „no adverse effect“ 2014 Geron restartuje zkoušky (Nature (2014) 510;18:7503) Klinicke zkoušky buněčných produktů nemají na růžích ustláno… … nebo mají? Geron: Klinicke zkoušky kmenových buněk nemají na růžích ustláno… … nebo mají? Embryonální kmenové buňky: 147 studií (srdeční selhání, degenerace sítnice, poškození močového měchýře, ALS, suchá forma makulární degenerace, poranění menisku, Parkinsonova choroba, svalová atrofie, intrauterinní adheze,ovariální nedostatečnost, erektilní dysfunkce, diabetes, arthritida) Indukované pluripotentní KB: 94 studií (podobné aplikace, jako u embryonálních kmenových buněk+diabeticka retinopatie, talasemie) Mezenchymální KB: 1458 studií (osteoartritida, anemie, encefalopatie, rekonstrukční svalová chirurgie + podobne jako výše) Stav na počátku roku 2024: Příklad: léčba diabetu – transplantace insulin sekretujících buněk Valasco-Cruz, 2019 Cell • iPSC and ESC derived pancreatic b-cells are responsive to glucose level • transplanted cells rapidly restore glucose tolerance in mouse • on going trial in humans Příklad: traumatické poškození krční míchy, myelopatie a léčba kmenovými buňkami Patofyziologie a strategie léčby KB Anatomie poškození Stav po transplantaci Výsledek: obnovení bílé a šedé hmoty v místě poškození obnovení funkčnosti motorických neuronů obnovení pohybových funkcí Model: laboratorní potkan Adaptováno ze Stem Cells, 2010 Makrofág Astrocyt Oligodendrocyt Axony s myelinem Progenitory oligodendrocytů Progenitory motoneuronů …Regnerace RPE… Úspěchy: Embryonální kmenové buňky Schwartz a kol. Lancet 2012; 379:713-20 Lidské embryonální kmenové buňky Diferenciace do pigmentového epitelu …Regnerace RPE… Úspěchy: Embryonální kmenové buňky Schwartz a kol. Lancet 2012; 379:713-20 Lidské embryonální kmenové buňky Diferenciace do pigmentového epitelu HOLOCLAR® odebrane limbalni buňky z rohovky rozmnožené v laboratoři a transplantované zpět do oka.. …Srdeční záplaty • 5% ejekční frakce • Trvalý pobyt na JIP • Mimotělní oběh • Prognóza v týdnech Teruo Okano: ISSCR Yokohama 2012; current status: unknown Pacient s akutním srdečním selháním (rozsáhlé jizvy) …Srdeční záplaty Teruo Okano: ISSCR Yokohama 2012; current status: unknown Odběr epitelu nosní sliznice: primokultura Reprogramace Indukované pluripotentní kmenové buňky Diferenciace Srdeční buňky Jak transplantovat tkáňovou kulturu do rozsáhlé jizvy na srdci? Pacient s akutním srdečním selháním (rozsáhlé jizvy) …Srdeční záplaty Pacient s akutním srdečním selháním (rozsáhlé jizvy) Odběr epitelu nosní sliznice: primokultura Reprogramace Indukované pluripotentní kmenové buňky Haraguchi a kol., SAGE-Hindawi Access to Research Cardiology Research and Practice, 2011 Teplosenzitivní materiál na tvorbu buněčné monovrstvy …Srdeční záplaty Pacient s akutním srdečním selháním (rozsáhlé jizvy) Odběr epitelu nosní sliznice: primokultura Reprogramace Indukované pluripotentní kmenové buňky Haraguchi a kol., SAGE-Hindawi Access to Research Cardiology Research and Practice, 2011 Teplosenzitivní materiál na tvorbu buněčné monovrstvy 3-D Diferenciace …Srdeční záplaty Pacient s akutním srdečním selháním (rozsáhlé jizvy) Odběr epitelu nosní sliznice: primokultura Reprogramace Indukované pluripotentní kmenové buňky Haraguchi a kol., SAGE-Hindawi Access to Research Cardiology Research and Practice, 2011 3-D Diferenciace30% ejekční frakce … pacient odchází z JIP Transplantace na jizvu 3-D srdeční záplata Teruo Okano: ISSCR Yokohama 2012; current status: unknown Transplantace trachei, vypěstované z vlastních epiteliálních buněk pacientce s genetickou stenozou Elliot a kol., Stem Cells Translational Medicine, 2017 Odběr epitelových buněk Expanze v primokultuře Repopulace decelularizovaného scafoldu od dárce Hybridní transplantace (autologní buňky + alogenní scafold) 15-letá dívka s akutní stenózou průdušnice Transplantace trachei, vypěstované z vlastních epiteliálních buněk pacientce s genetickou stenozou Elliot a kol., Stem Cells Translational Medicine, 2017 Odběr epitelových buněk Expanze v primokultuře Repopulace decelularizovaného scafoldu od dárce Hybridní transplantace (autologní buňky + alogenní scafold) 15-letá dívka s akutní stenózou průdušnice Transplantace trachei, vypěstované z vlastních epiteliálních buněk pacientce s genetickou stenozou Elliot a kol., Stem Cells Translational Medicine, 2017 Odběr epitelových buněk Expanze v primokultuře Repopulace decelularizovaného scafoldu od dárce Hybridní transplantace (autologní buňky + alogenní scafold) 15-letá dívka s akutní stenózou průdušnice V říjnu 2023 odsouzen ke 3 letům Svédská odborná komise našla důkazy vědeckého podvodu v 6 publikacích, což vedlo ke stažení 11 Macciariniho článků.. V říjnu 2023 odsouzen ke 3 letům Svédská odborná komise našla důkazy vědeckého podvodu v 6 publikacích, což vedlo ke stažení 11 Macciariniho článků.. Trounson, 2016 Výběr recentních aplikací PSC v klinických studiích 2020 (Clinicaltrials.gov): 89 studies using hiPSC (Generation of clinical grade products) 41 studies using hESC (Heart failure, intrauterine adhesions, Retina, ALS, meniskus, Parkinsons, Diabetes) Co by se nám hodilo, ale tkáňové kultury jsou na to zatím krátké… • Cca 1000 pacientů ročně potřebuje transplantaci kostní dřeně • Trvalý nedostatek dárců (dlouhé čekací lhůty) • Umíme kultivovat hematopoetické buňky z kostní dřeně?…. Co by se nám hodilo, ale tkáňové kultury jsou na to zatím krátké… Funkční na myších - zwitteriontový hydrogel – mimikuje scafold kostní dreně Základ: Poly(carboxybetaine acrylamide) • Cca 1000 pacintů ročně potřebuje transplantaci kostní dřeně • Trvalý nedostatek dárců • Umíme kultivovat hematopoetické buňky z kostní dřeně…. …. ale nezachovávají si klonogenní diferenciační potenciál) Hong, 2022.. https://doi.org/10.1039/D2TB01211A Bezpečnost a etika Jakákoliv aplikace PKB je podmíněna kvantitativní diferenciací do kýžené tkáně Vztah mezi pluripotencí a tumorogenicitou (a) Telomeráza (b) Absence kontaktní inhibice (c) Silný antiapoptotický aparát (d) Vysoká proliferační schopnost Kooreman, J R Soc Interface. 2010 Technologie ke zvýšení bezpečnosti transplantace produktů z pluripotentních kmenových buněk Nediferencované pluripotentní kmenové buňky Diferenciace Heterogenní populace Nechtěný diferencovaný produkt Nediferencovaná buňka Bezpečnostní riziko 1: Tvorba teratomu Bezpečnostní riziko 2: Nechtěná diferencovaná buňka se rozmnoží – rakovina, nebo zánět Transplantace Bezpečnostní rizika transplantace produktů z kmenových buněk: 1. Tvorba teratomů a teratokarcinomů z kontaminace pluripotentními buňkami 2. Množení nechtěných typů diferencovaných buněk – nebezpečí nádoru, nebo zánětu Martin a kol., Nature Communication, 2020 Technologie ke zvýšení bezpečnosti transplantace produktů z pluripotentních kmenových buněk Nediferencované pluripotentní kmenové buňky Diferenciace Heterogenní populace Nechtěný diferencovaný produkt Nediferencovaná buňka Bezpečnostní riziko 1: Tvorba teratomu Bezpečnostní riziko 2: Nechtěná diferencovaná buňka se rozmnoží – rakovina, nebo zánět Transplantace Bezpečnostní rizika transplantace produktů z kmenových buněk: 1. Tvorba teratomů a teratokarcinomů z kontaminace pluripotentními buňkami 2. Množení nechtěných typů diferencovaných buněk – nebezpečí nádoru, nebo zánětu Martin a kol., Nature Communication, 2020 WHO (World Health Organization) EMA (European Medical Agency) SUKL (Státní Ústav pro Kontrolu Léčiv) Nutné prokázat, že preparát neobsahuje více, než 1 pluripotentní buňku na 1 000 000 buněk.. „Good practice“. Nature 2014 Technologie ke zvýšení bezpečnosti transplantace produktů z pluripotentních kmenových buněk Bezpečnostní rizika transplantace produktů z kmenových buněk: 1. Tvorba teratomů a teratokarcinomů z kontaminace pluripotentními buňkami 2. Množení nechtěných typů diferencovaných buněk – nebezpečí nádoru, nebo zánětu Martin a kol., Nature Communication, 2020 MEASURE (Japonská obdoba WHO) (Multisite Evaluation Study on Analytical Methods for Non-Clinical Safety Assessment of Human-Derived Regenerative Medical Products) Standardizace léčebných přípravků na bázi kmenových buněk: 1:1 000 000 s pomocí HEC analýzyHEC assay: Disociace TrypLE na bázi trypsinu Suspenze jednotlivých buněk „off the shelf“ produkt Ředění suspenze Nárůst kolonií z jednotlivých buněk Speciální medium Essential 8TM Počet kolonií Počet nasazených buněk < 1 106 Nutné prokázat, že preparát neobsahuje více, než 1 pluripotentní buňku na 1 000 000 buněk.. Technologie ke zvýšení bezpečnosti transplantace produktů z pluripotentních kmenových buněk Eliminuje pluripotentní kmenové buňky Nechtěný diferencovaný produkt Nediferencovaná buňka Editace genomu pluripotentních kmenových buněk – i) Vložení genu kaspázy pod promotor NANOGu (NANOG je pluripotenční transkripční faktor) ii) Vložení dimerizačních sekvencí v přítomnosti speciální molekuly do genu kaspázy 9 – indukuje apoptózu iii) Vložení genu pro metabolizaci Gancicloviru – toxický produkt pro dělící se buňky Bezpečnostní rizika transplantace produktů z kmenových buněk: 1. Tvorba teratomů a teratokarcinomů z kontaminace pluripotentními buňkami 2. Množení nechtěných typů diferencovaných buněk – nebezpečí nádoru, nebo zánětu Eliminuje celý produkt v případě nežádoucích účinků Eliminuje dělící se buňky odvozené od hPSC Martin a kol., Nature Communication, 2020 Technologie ke zvýšení bezpečnosti transplantace produktů z pluripotentních kmenových buněk Zabrání teratomu Nediferencovaná buňka Editace genomu pluripotentních kmenových buněk – i) Vložení genu kaspázy pod promotor NANOGu (NANOG je pluripotenční transkripční faktor) ii) Vložení dimerizačních sekvencí v přítomnosti speciální molekuly do genu kaspázy 9 – indukuje apoptózu iii) Vložení genu pro metabolizaci Gancicloviru – toxický produkt pro dělící se buňky Bezpečnostní rizika transplantace produktů z kmenových buněk: 1. Tvorba teratomů a teratokarcinomů z kontaminace pluripotentními buňkami 2. Množení nechtěných typů diferencovaných buněk – nebezpečí nádoru, nebo zánětu Eliminuje dělící se buňky odvozené od hPSC Nechtěný diferencovaný produkt Eliminuje celý produkt v případě nežádoucích účinků Zabrání teratomu Martin a kol., Nature Communication, 2020 ..aneb je libo jedno kontroverzní téma na závěr..? Nad organoidem je už jen celý orgán.. múžeme ho vytvořit? Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) • Běžný postup tvorby transgenních myší (řízená mutageneze ES před implantací do blastocysty) Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) • Běžný postup tvorby transgenních myší (řízená mutageneze ES před implantací do blastocysty) • Přes 100 tis kmenů transgenních myší po světě Sbírky kmenů transgenních myší IMSR Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Bavíme se o myších, co takhle mezidruhové chiméry…? Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Rui, Protein & Cell, 2020 Prase domácí Makak jávský -buňky označené zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) - 2 narozené chiméry. - Opičí buňky v srdci, játrech, slzině, plicích a kůži, ale jide ne.. Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Rui, Protein & Cell, 2020 Prase domácí Makak jávský -buňky označené zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) Ale my chceme chiméry s plně vyvinutými orgány jednoho druhu.. Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Komplementace blastocysty: Pdx1-/- MYŠ Netvoří se slinivka Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799 Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Komplementace blastocysty: Embryonic stem cells Pdx1-/- MYŠ POTKAN WT Netvoří se slinivka Blastocysta Blastocyst injection MYŠ Myš s krysí slinivkou Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799 US UK Mezidruhové chiméry pro výzkum a transplantační medicínu Juan Carlos Izpisua Belmonte Methods Mol Biol. 2019;2005:101-124. Human – Pig Chimera Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí Tvorba chimér: - Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk - Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty) Korektní vývoj chimér 28 dní (převážné prsečí embrya s lidským podílem 1/10 000 buněk) Právní ochrana embrya a plodu.. ..před biotechnologiemi Korektní vývoj chimér 28 dní (převážné prsečí embrya s lidským podílem 1/10 000 buněk) (lékařský slovník: Od početí až po 9. týden se jedná o embryo, po 9. týdnu až po narození o plod) DO 12. TÝDNE: Zničení embrya nebo usmrcení plodu není protiprávní, pokud je provedeno dle: „Interrupčního zákona“ - zákona č. 66/1986 Sb. nebo zákona č. 227/2006 Sb (..o kmenových buňkách) Lze v ČR aplikovat zmíněné biotechnologické postupy zahrnující chimerní embrya? Co myslíme EMBRYEM, když mluvíme O kmenových buňkách • preimplantační stádium • blastocysta 4 dny stará • tvoří ji několik desitek buněk • embryoblast a trofoblast ~9000 embryí implantováno (většinou po třech) ročně v ČR zbytek >50% zůstane zamražen a … "[T]he bottom line is that there are 400,000 frozen embryos in the United States, and a large percentage of those are going to be thrown out. Regardless of what you think the moral status of those embryos is, it makes sense to me that it's a better moral decision to use them to help people than just to throw them out. It's a very complex issue, but to me it boils down to that one thing." James Thompson The destruction of human embryos to harvest stem cells is "not only devoid of the light of God but is also devoid of humanity" and "does not truly serve humanity." Benedict XIV Zákon 227/2006 Sb Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů - Státem provozovaný registr linií lidských embryonálních kmenových buněk - Výzkum lze provádět výhradně s povolením MŠMT - Výzkum/činnost nesmí vést k vytvoření jedince (klonování) Zákon 273/2011 Sb - Skladování embryí neomezenou dobu (EU většinou 5 let) - Likvidace embryí po 10 letech, pokud si pár nepřeje jinak Zákon 227/2006 Sb Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů „Zamražená generace“ – cca ½ milionu zmražených embryí v US ČR: skladovaní embryí (ČR) …. ~ 10 000 Kč (jednorázově v roce 2007 – 3400 asistovaných reprodukcí §9 odstavec 1: a) je možné udělit, je-li zřejmé, že jde o nadbytečné lidské embryo, a zároveň dříve, než dojde k jeho použití k získání lidských embryonálních kmenových buněk. Albert Lasker basic medical research award 2009 Indukované pluripotentní KB (Yamanaka 2006) Thy1 (a další geny typické pro fibroblasty)) 0 4 8 12 retrovirová aktivita markery pluripotentních KB geny pluripotence aktivita telomerázy umlčení chromozomu X Somatické buňky Např. kožní fibroblasty iPS buňky Čas ve dnech Stabilní reprogramace na “kmenovost” Alternativní zdroj pluripotence - Indukované pluripotentní KB (iPS cells) - KB vytvořené ze somatických tj. diferencovaných buněk pomocí genetické metody Kinetika reprogramace fibroblastů do pluripotentních KB - relativně krátká cesta zpět Oct4 Sox2 c-Myc Klf4 iPS jsou schopny vytvořit chimérní organizmus Oct-4 GFP fibroblasty Oct-4 GFP iPS Nanog GFP iPS Injekce chiméry (bílá a hnědá srst) Nanog GFP iPS chiméra Oct-4 GFP iPS chiméra Brambrink et al. Cell Stem Cell, February 2008 Etický problém s hiPSC? • není potřeba destrukce embrya • pro “reprogramaci” lze použít vlastní buňky pacienta a odpada tak riziko GVH Zákon upravuje použití iPS pouze jako GMO.. LIDSKÉ INDUKOVANÉ PLURIPOTENTNÍ KMENOVÉ BUŇKY Zárodečné buňky z pluripotentních Diferenciace do PGC Spermatocyt Oocyt Preimplantační embryo Hubner, Science, 2003 ? Etický problém s hiPSC …. I Zákon 78/2004 Sb Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění pozdějších předpisů Vyhláška č. 209/2004 Sb., o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty § 22 odst 1) Ministerstvo vede registr geneticky modifikovaných organismů.. § 35a odst 12) Za přestupek lze uložit pokutu do a) 5 000 000 Kč, jde-li o přestupek podle odstavce 1 písm. b), c) nebo f), Děkuji za pozornost.. Vladimír Rotrekl vrotrekl@med.muni.cz Někdo ke mně na PhD?... PhD students Děkuji za pozornost.. Vladimír Rotrekl vrotrekl@med.muni.cz