Biotechnologické procesy
Dnes o živočišných buňkách, potažmo pak o skupině živočišných buněk,
kterým říkáme kmenové buňky
Blok III.
Vladimír Rotrekl @ 2020
Biotechnologické procesy: Živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky:
Sylabus
1) Úvod do živočišných buněk a jejich specifik, potence a diferenciace, Hayflickuv limit, imortalizované linie, kultivace a
jejich diferenciace (včetně large scale, GMP a industry grade)
2) Použití živočišných buněk k výrobě léčiv, použití živočišných, potažmo kmenových buněk ve screeningu a výrobě
léčiv, využití živočišných kultur v toxikologii
3) Živočišné buňky a buněčná terapie, kde končí transplantace a začíná biotechnologie, metody, příklady, požadavky
SUKL/EMA na jejich výrobu a použití
4) Speciální aplikace a výhled do budoucna (3D kultivace, Organoidy, 3D tisk buněk, in vitro tvorba náhražek tkání a
orgánů, genová )
Vladimír Rotrekl @ 2020
Stále tady mluví o organoidech!
…nechtěl by už třeba vysvětlit, co to ten organoid je?
Co nazýváme organiodem
• 3D struktura odvozená z kmenových buněk
• Vykazuje schopnost „samoroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán
• Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán)
• Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu
Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky Organoidy
Co nazýváme organiodem
• 3D struktura odvozená z kmenových buněk
• Vykazuje schopnost „samoroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán
• Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán)
• Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu
Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky Organoidy
Velikost organoidů je omezena difuzí kyslíku
~ desetiny až jednotky milimetrů
Zdroj: Unisense
Co nazýváme organiodem
• 3D struktura odvozená z kmenových buněk
• Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán
• Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán)
• Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu
Adaptováno z Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
samoorganizace
Co nazýváme organiodem
• 3D struktura odvozená z kmenových buněk
• Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán
• Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán)
• Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu
Adaptováno z Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
Střevní krypta
disociace samoorganizace
Co nazýváme organiodem
• 3D struktura odvozená z kmenových buněk
• Vykazuje schopnost „samooroganizace“ na základě stejných principů, jako modelovaný orgán
• Obsahuje více buněčných typů (stejných jako modelovaný orgán)
• Struktura získá a uchovává (alespoň některé) specializované funkce modelovaného orgánu
Adaptováno z Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
Střevní krypta
disociace samoorganizace růst jako v orgánu
Výroba organiodů
• Ze směsi primárních buněk, obsahujících buňky kmenové (dospělé)
• Z pluripotentních kmenových buněk diferenciací
• Z rakovinných buněk odvozených z rakoviny modelovaného orgánu
Adaptováno z Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
Střevní krypta
disociace samoorganizace růst jako v orgánu
Tenké střevo
Hu, Cell, 2018
Omezené možnosti zisku explantátu z člověka – většinou zvířecí organoidy..
disekce
Výroba organiodů
• Ze směsi primárních buněk, obsahujících buňky kmenové (dospělé)
• Z pluripotentních kmenových buněk diferenciací
• Z rakovinných buněk odvozených z rakoviny modelovaného orgánu
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
Střevní krypta
disociace samoorganizace růst jako v orgánu
Tenké střevo
disekce
Pluripotentní kmenové buňky Primokultura fibroblastů
Biopsie např. kůže
Časná blastocysta
• Jsme technologicky omezení, co
dokážeme diferencovat z
kmenových buněk in vitro..
Výroba organiodů
• Ze směsi primárních buněk, obsahujících buňky kmenové (dospělé)
• Z pluripotentních kmenových buněk diferenciací
• Z rakovinných buněk odvozených z rakoviny modelovaného orgánu
Adaptováno z Crownbio..
(Směs buněk obsahující)
Kmenové buňky
Sféroidy
Organoidy
Střevní krypta
disociace samoorganizace růst jako v orgánu
Tenké střevo
Střevní kryptakolorektální karcinom/adenom Pluripotentní kmenové buňky
Co vše musíme vychytat, abychom vypěstovali organoid..
…technologie
Shamir, 2014
Od 2D kultury k organoidům
• Vzrůstající množství buněčných kontaktů
• Vzrůstající potřeba okysličení
• Vzrústající nároky na na mikroprostředí („niche“)
• Vzrůstající komplexita kultury (kokultura)
• Vzrůstající komplexita řízení signálních drah
Faktory umožňující diferenciaci a tvorbu organoidů
Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
• Růstové faktory a cytokiny (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, …)
• Ionty (Ca++, …)
• Cukry (glu – zrání L-buněk)
Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
Polarita a tvar buněk
Fyzikální parametry prostředí (teplota, tenze O2, …)
Jsou intracelulárně zpracovány regulačními/signálními
dráhami a komplexními regulačními sítěmi zahrnujícími
signální molekuly (proteiny) a expresi genetické informace
Změny biochemismu a
metabolické aktivity
buněk – tím k určení
osudu..
„niche“ faktory (aneb recyklace
morfogenů)
R-spondin, WNT ligandy, Retinova kyselina,
inhibitory GSK3b a TGF-b
EGF, FGF, HGF, inhibitory HDAC
Noggin, Activin A, Gastrin, inhibitory p38
ECM faktory
Kolagen, Laminin, Entaktin, Fibronektin
Diferenciační faktory
BMP, TGF-b, Inhibitory NOTCH, EGF
R-spondin, WNT, Noggin
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
„niche“ faktory (aneb recyklace
morfogenů)
R-spondin, WNT ligandy, Retinova kyselina,
inhibitory GSK3b a TGF-b
EGF, FGF, HGF, inhibitory HDAC
Noggin, Activin A, Gastrin, inhibitory p38
ECM faktory
Kolagen, Laminin, Entaktin, Fibronektin
Diferenciační faktory
BMP, TGF-b, Inhibitory NOTCH, EGF
R-spondin, WNT, Noggin
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Mital a kol., Nature Comm, 2020
Odpovídá
blastocystě E5
Tvorba DE (E7) Vývoj zadního
střeva (E18+)
Model střevní
krypty
Extracelulární matrice umožnila 3D kultivaci a diferenciaci
Buněčná adheze:
• Aktivace integrinů
vazbou na
Laminin/Fibronektin
Migrace
Proliferace
Genová exprese
Přežití
Zástava buněčného cyklu
Apoptóza
Senescence
Faktory umožňující diferenciaci a tvorbu organoidů
• Absence adheze
Extracelulární matrice umožnila 3D kultivaci a diferenciaci
Faktory umožňující diferenciaci a tvorbu organoidů
Vitillo, Stem Cell Reports,2016
Nieberler, Cancers,2017
integriny
laminin/fibronektin extracelulární matrice (ECM)
AKTERK GSK3b
PŘEŽITÍPROLIFERACE MIGRACE
Buněčná
signalizace
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Sebeobnova
Activin A
FGF
BMP4
WNT
Kmenová
buňka
Mattingly, WIREs Dev Biol 2015
Diferenciace
Autokrinní spolu s parakrinním signálováním a adhezí indukovaným
signálem určuje osud buňky..
..(být či nebýt, sebeobnovovat se či diferencovat atd..)
Autokrinní
signál
Parakrinní
signál
kolagen
laminin
Adheze
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Sebeobnova
Activin A
FGF
BMP4
WNT
Kmenová
buňka
Mattingly, WIREs Dev Biol 2015
Diferenciace
Autokrinní spolu s parakrinním signálováním a adhezí indukovaným
signálem určuje osud buňky..
..(být či nebýt, sebeobnovovat se či diferencovat atd..)
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Sebeobnova
Activin A
FGF
Kmenová
buňka
Signální dráhy řídící tvorbu embrya (primitivního proužku)
BMP4
WNT
Diferenciace
Embryonální vývoj
Zygota Morula Blastula
Blastocysta
Primitivní proužek
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Sebeobnova
Activin A
FGF
Kmenová
buňka
Signální dráhy řídící tvorbu embrya (primitivního proužku)
Retinová kyselina
Ustavení AP osy
Ribes, Development 2009
Zhang, PLOS 2015
RA indukuje tvorbu ektodermu z PSC
Stavridis, Development, 2010
BMP4
WNT
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
„Niche“ – klíčové faktory mikroprostředí
Sebeobnova
Activin A
FGF
Kmenová
buňka
BMP4
WNT
Diferenciace
Signální dráhy řídící tvorbu embrya – použití pro
diferenciaci in vitro
Faktory mikroprostředí kopírují mikroprostředí cílového orgánu, případně jeho embryonálního vývoje
Tkáňové kultury – tvorba organoidů..
Signální dráhy řídící tvorbu embrya – použití pro
diferenciaci in vitro
Tkáňové kultury – tvorba organoidů..
Tkáňové kultury – tvorba organoidů..
Využití organoidů
Modelování chorob
Testování léčiv
Transplantační medicína
Genová léčba
Jak to všechno začalo..
..aneb zrod organoidů
Živočišné tkáňové kultury - organoidy
Střevní epitel se obnoví každých 4-5 dní
Nové buňky diferencují z kmenových
buněk
Maturované buňky apoptují na vrcholu
klků
Živočišné tkáňové kultury - organoidy
Kmenové buňky střevního epitelu
Proliferace
Diferenciace
Apoptóza
čas
Živočišné tkáňové kultury - organoidy
Kmenové buňky střevního epitelu
Proliferace
Diferenciace
Apoptóza
disociace
Sortování průtokovou
cytometrií (marker GFP-Lgr5)
Kmenové buňky střevního
epitelu (Lgr-GFP) v kultuře
Izolace primokultury kmenových buněk ze střevního epitelu
Živočišné tkáňové kultury - organoidy
Růst organoidů z kmenových buněk střevního epitelu
Plně vyvinutý organoid
(„ministřevo“) s funkčními klky
střevního epitelu
Sato, Nature 2009
Proliferace pouze v kryptě klku
(červená = proliferace)
Živočišné tkáňové kultury - organoidy
„ministřevo“ obsahuje všechny typu buněk střevního epitelu
Sato, Nature 2009
Enterocyty Pohárové buňky Panethovy buňky Enteroendokrinní buňky
Modelování idiopatického střevního zánětu ve střevních organoidech
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Schulte, Stem Cells Int., 2019
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Mechanizmus infekce žaludeční sliznice bakterií Heliobacter pylori
• 50% populace je nakaženo
• 90% bezpříznakový průběh (dočasný)
• Většina případů žaludečního vředu je asociována s H.pylori
• H.pylori je karcinogen I.třídy (hlavní příčina karcinomu žaludku)
Mechanizmus infekce žaludeční sliznice bakterií Heliobacter pylori
Bartfield, Gastroenterology2015
Žaludeční organoidy infikovány H.pylori
Zelený H.pylori (zelená) asociuje s proliferujícími
buňkami (kmenovými) žaludečního epitelu
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Mechanizmus infekce žaludeční sliznice bakterií Heliobacter pylori
Žaludeční organoidy infikovány H.pylori
Helicobacter pylori
Asociace s C-MET receptorem
Epitelialní proliferace
Mc Cracken,Nature, 2014
Otevírá cestu k testování a současně představuje robustní skríningový systém selektivních inhibitorů/antagonistů c-met receptoru..
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Plicní organoidy
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Pluripotentní kmenové buňky
Sigma/Merck
Plicní organoidy
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Pluripotentní kmenové buňky
Sigma/Merck
Definitive Endoderm Induction Medium (SCM302)
Anterior Foregut Endoderm Induction Medium I (SCM305)
Anterior Foregut Endoderm Induction Medium II (SCM306)
3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307)
3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308)
Human iPSC Derived AFE Progenitors (SCC301)
Sigma-Aldrich
: personalizovaná medicína pro pacienty trpící cystickou
fibrózou
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
• Mutace genu CTFR chloridového kanálu
• Hustý hlen, ztěžující dýchání
• Průměrný věk dožití dospělých s CF je 44 let
Plicní organoidy
: personalizovaná medicína pro pacienty trpící cystickou
fibrózou
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Střevní organoidy
Střevní organoid
Forskolin
Forskolin Adenylat cykláza
ATP
cAMP
Cl
•
Forskolin otevírá CTFR kanál:
• Otevření CTFR – bobtnání orgnoidu:
StemCell Technologies
: personalizovaná medicína pro pacienty trpící cystickou
fibrózou
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Střevní organoidy
• Forskolin otevírá CTFR kanál:
Forskolin
Zdravý jedinec Pacient s CF
60-120 min
Firma Vertex:
• Skríning >2000 mutací
• Nalezeny dvě účinné látky
• V současnosti povoleny k léčbě
jako lék ORKAMBI
: personalizovaná medicína pro pacienty trpící cystickou
fibrózou
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Střevní organoidy
• Forskolin otevírá CTFR kanál:
Forskolin
Zdravý jedinec Pacient s CF
60-120 min
Firma Vertex:
• Skríning >2000 mutací
• Nalezeny dvě účinné látky
• V současnosti povoleny k léčbě
jako lék ORKAMBI
Dánská zdravotní pojišťovna zaplatila takový
skríning pro cca 200 dětí.
Pokrytá většina mutací CTFR (a jejich odpověď na
léčbu vybranými léky
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Lidské organoidy jsou vhodné k editaci genomu s pomocé CRISP/Cas9
Oprava genu CTFR ve střevním organoidu
Organoidy:
Nesoucí mutaci CTFR
(nemocný)
Opravený gen CTFR
forskolin
Podařilo se obnovit funkci CTFR genu v organoidu..
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Lidské organoidy systematický přístup k hledání nových léčiv
Dnes k dispozici stovky
pacientů:
• Rakovina tlustého střeva
• Rakovina prsu
• Rakovina vaječníků
• Rakovina slinivky
…a bio+databanka neustále
roste
Tvorba a využití biobanky s organoidy k systematickému hledání účinných protinádorových látek
Pacienti s rakovinou tlustého střeva:
• Biopsie rakovinné a zdrané tkáně
• Výroba organoidů
• Analýza genomu a transkriptomu
• Skríning léčiv
van de Wetering, Cell 2015
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Transplantace střevních organiodů
1. Transplantace organoidů do místa poškozené tkáně
2. Transplantace organoidu s editovaným genomem (zatím spíše model rakoviny)
Biopsie
+kultivace
funkčního
organoidu
Transplantace
do poškozené
tkáně
Biopsie
+kultivace
funkčního
organoidu
Transplantace =
myší rakovinný
model
CRISP/Cas9
carcinogenesis
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Transplantace střevních organiodů
Spontanni colitida s
vysokou mortalitou
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Transplantace jaterních organiodů
G Vogel Science 2013;341:946-947
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Mozkové (neurální) organoidy – modelování chorob..
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Mozkové (neurální) organoidy – modelování chorob..
Angelmanuv syndrom – dříve nazýván „Happy puppet“
- drobná postava, menší hlava (ale ne mikrocefalus)
- vážná mentální retardace
- epileptické záchvaty
- motorické problémy
- problémy s rovnováhou
- dítě se nadměrně (neůměrně) směje
- mutace genu UBE3A na X chromozomu – kóduje ubikvitin ligázu E3A
Zdroj: Wiki
Sun A.X. et al. Science 366, 1486-1492 (2019)
UBE3A KO
hESC
Modelování choroby:
Živočišné tkáňové kultury – organoidy a příklady užití
Mozkové (neurální) organoidy – modelování chorob..
Sun A.X. et al. Science 366, 1486-1492 (2019)
UBE3A KO
hESC
• UBE3A má za úkol degradaci draselného kanálu BK
• Neurony vykazují zvýšený draslíkový proud
• Antagonista BK kanálu Paxillin dokáže normalizovat hyperstipmulaci neuronů a
zabránit epileptickým záchvatům u modelové myši..
Aktivita neuronů v UBE3A KO organoidu..Modelování choroby:
Angelmanuv syndrom – dříve nazýván „Happy puppet“
… a jak se vlastně takový organoid dá vyrobit?
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Narostlé kolonie celé odloupnout (kolagenáza, EDTA+mechanicky atd) nebo monovrstvu narušit na
makroskopické shluky buněk..
• Přenést do misky/lahve/bioreaktoru s neadhezivním povrchem (např. plastová bakteriální Petriho miska)
Mechanická/
enzymatická
disociace na
shluky buněk
Lidské embryonální buňky
1mm
Embryoidní tělísko
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
Flamier, PLOS ONE, 2017
➢ Disociace tkáňové kultury na jednotlivé buňky
musí být opatrná, aby nepoškodila přiléhající ECM a receptory
buněk
(např. Akutáza, trypsin atd..)
➢ Napipetování optimalizovaného množství buněk do jamky
➢ Optional: Cytospin
➢ Samovolná agregace buněk např. za vytvoření tzv.
embryoidního tělíska
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
➢ Disociace tkáňové kultury na jednotlivé buňky
musí být opatrná, aby nepoškodila přiléhající ECM a receptory
buněk
(např. Akutáza, trypsin atd..)
➢ Napipetování optimalizovaného množství buněk do jamky
➢ Optional: Cytospin
➢ Samovolná agregace buněk např. za vytvoření tzv.
embryoidního tělíska
1) Mechanická/enzymatická disociace na shluky buněk
Lidské embryonální buňky Embryoidní tělísko
2) Embryoidní tělíska vytvořená z buněčné suspenze na mikrojamkách
Výhoda v homogenitě a reprodukovatelnosti
Porovnání mechanické a mikrojamkové tvorby agregátů
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
➢ Disociace tkáňové kultury na jednotlivé buňky
musí být opatrná, aby nepoškodila přiléhající ECM a receptory
buněk
(např. Akutáza, trypsin atd..)
➢ Napipetování optimalizovaného množství buněk do jamky
➢ Optional: Centrifugační agregace
➢ Samovolná agregace buněk např. za vytvoření tzv.
embryoidního tělíska
Agrewell
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
• 3D tisk Pati,
Nature Communication 2014
Snaha o získání 3D matrice,
nebo přímo natištěné tkáňové
kultury, které umožní:
- adhezi buněk
- regulaci interakce s ECM
- regulaci hustoty buněk
- konstrukci praktických tvarů
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
• 3D tisk - matric
Agilent Technologies
Materiály:
Agaroza, Alginát, chitosan,
kolagen, decelularizovaná ECM,
Fibrin/fibrinogen, Želatina,
grafen, hyaluronová kyselina,
hydroxylapatit,atd..
Vždy je nutné otestovat kompatibilitu daného materálu s konkrétní buněčnou kulturou.
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
• 3D tisk - matric
Agilent Technologies
Materiály (většinou tzv.
hydrogely):
Agaroza, Alginát, chitosan,
kolagen, decelularizovaná ECM,
Fibrin/fibrinogen, Želatina,
grafen, hyaluronová kyselina,
hydroxylapatit,atd..
Vždy je nutné otestovat kompatibilitu daného materálu s konkrétní buněčnou kulturou.
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba buněčných agregátů
• Mechanické suspenzní metoda (kolonie, části monovrstvy atd.)
• Gravitační agregace (jamky, cytospin)
• 3D tisk - matric
- přímý tisk
tkáňových kultur
Sigma/Merck
..aneb je libo jedno kontroverzní téma na závěr..?
Nad organoidem je už jen celý orgán.. múžeme ho vytvořit?
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
• Běžný postup tvorby transgenních myší (řízená mutageneze ES před
implantací do blastocysty)
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
• Běžný postup tvorby transgenních myší (řízená mutageneze ES před
implantací do blastocysty)
• Přes 100 tis kmenů transgenních myší po světě
Sbírky kmenů transgenních myší IMSR
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Bavíme se o myších, co takhle mezidruhové chiméry…?
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Rui, Protein & Cell, 2020
Prase domácí
Makak jávský -buňky označené zeleným
fluorescenčním proteinem (GFP)
- 2 narozené chiméry.
- Opičí buňky v srdci, játrech, slezině, plicích a kůži, ale i jinde..
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Rui, Protein & Cell, 2020
Prase domácí
Makak jávský -buňky označené zeleným
fluorescenčním proteinem (GFP)
Ale my chceme chiméry s plně vyvinutými orgány jednoho druhu..
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Komplementace blastocysty:
Pdx1-/-
MYŠ
Netvoří se slinivka
Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Komplementace blastocysty:
Embryonic stem cells
Pdx1-/-
MYŠ
POTKAN
WT
Netvoří se slinivka
Blastocysta
Blastocyst injection
MYŠ
Myš s potkaní slinivkou
Kobayashi T, et al. 2010 Cell 142(5):787–799
US
UK
Mezidruhové chiméry pro
výzkum a transplantační
medicínu
Juan Carlos Izpisua Belmonte
Methods Mol Biol. 2019;2005:101-124.
Human – Pig Chimera
Živočišné tkáňové kultury – Tvorba chimérních embryí
Tvorba chimér:
- Tkáňovou kulturu embryonálních kmenových buněk, nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk
- Implantace mikroinjekcí pluripotentních buněk do časného embrya (od 8-buněčné blastuly do preimplantační blastocysty)
Děkuji za pozornost..
Vladimír Rotrekl
vrotrekl@med.muni.cz