Biotechnologické procesy
Dnes o živočišných buňkách, potažmo pak o skupině živočišných buněk,
kterým říkáme kmenové buňky
Vladimír Rotrekl @ 2023
Co mají společného živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky s biotechnologií?
• Produkce vakcín
• Produkce protilátek (monoklonálních a rekombinantních)
• Testování metabolizmu léčiv (farma industry)
• Testování cytotoxicity látek
• Produkce biologických látek (růstové faktory, hormony, terapeutické proteiny)
• Produkce buněk k buněčné transplantaci
• Tvorba náhradních tkání/orgánů k transplantaci
Biotechnologické procesy: Živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky:
Sylabus
1) Úvod do živočišných buněk a jejich specifik, potence a diferenciace, Hayflickuv limit, imortalizované linie, kultivace a
jejich diferenciace (včetně large scale, GMP a industry grade)
2) Použití živočišných buněk k výrobě léčiv, použití živočišných, potažmo kmenových buněk ve screeningu a výrobě
léčiv
3) Živočišné buňky a buněčná terapie, kde končí transplantace a začíná biotechnologie, metody, příklady, požadavky
SUKL/EMA na jejich výrobu a použití
4) Speciální aplikace a výhled do budoucna (3D kultivace, Organoidy, 3D tisk buněk, in vitro tvorba náhražek tkání a
orgánů, genová )
Vladimír Rotrekl @ 2020
1878: Claude Bernard proposed that physiological systems of an organism can be maintained in a living system after
the death of an organism.
1885: Roux maintained embryonic chick cells in a saline culture.
1897: Loeb demonstrated the survival of cells isolated from blood and connective tissue in serum and plasma.
1903: Jolly observed cell division of salamander leucocytes in vitro.
1907: Harrison cultivated frog nerve cells in a lymph clot held by the ‘hanging drop’ method and observed the growth
of nerve fibres in vitro for several weeks. He was considered by some as the father of cell culture.
1910: Burrows succeeded in long-term cultivation of chicken embryo cell in plasma clots. He made detailed observation
of mitosis.
1911: Lewis and Lewis made the first liquid media consisted of sea water, serum, embryo extract, salts and peptones.
They observed limited monolayer growth.
1913: Carrel introduced strict aseptic techniques so that cells could be cultured for long periods.
1916: Rous and Jones introduced proteolytic enzyme trypsin for the subculture of adherent cells.
1923: Carrel and Baker developed ‘Carrel’ or T-flask as the first specifically designed cell culture vessel. They employed
microscopic evaluation of cells in culture.
1927: Carrel and Rivera produced the first viral vaccine – Vaccinia.
1933: Gey developed the roller tube technique.
1940s: The use of the antibiotics penicillin and streptomycin in culture medium decreased the problem of contamination
in cell culture.
1948: Earle isolated mouse L fibroblasts which formed clones from single cells. Fischer developed a chemically
defined medium, CMRL 1066.
Historický pohled na živočišné tkáňové kultury
1949: Enders reported that polio virus could be grown on human embryonic cells in culture.
1952: Gey established a continuous cell line from a human cervical carcinoma known as HeLa (Helen Lane) cells. Dulbecco
developed plaque assay for animal viruses using confluent monolayers of cultured cells.
1954: Abercrombie observed contract inhibition: motility of diploid cells in monolayer culture ceases when contact is
made with adjacent cells.
1955: Eagle studied the nutrient requirements of selected cells in culture and established the first widely used chemically
defined medium.
1961: Hay flick and Moorhead isolated human fibroblasts (WI-38) and showed that they have a finite life-span in culture.
1964: Littlefield introduced the HAT medium for cell selection.
1965: Ham introduced the first serum-free medium which was able to support the growth of some cells.
1965: Harris and Watkins were able to fuse human and mouse cells by the use of a virus.
1975: Kohler and Milstein produced the first hybridoma capable of secreting a monoclonal antibody.
1978: Sato established the basis for the development of serum-free media from cocktails of hormones and growth factors.
1982: Human insulin became the first recombinant protein to be licensed as a therapeutic agent.
1985: Human growth hormones produced from recombinant bacteria was accepted for therapeutic use.
1986: Lymphoblastoidy γlFN licensed.
1987: Tissue-type plasminogen activator (tPA) from recombinant animal cells became commercially available.
1989: Recombinant erythropoietin in trial.
1990: Recombinant products in clinical trial (HBsAG, factor VIII, HIVgp120, CD4, GM-CSF, EGF, mAbs, IL-2).
Historický pohled na živočišné tkáňové kultury
1949: Enders reported that polio virus could be grown on human embryonic cells in culture.
1952: Gey established a continuous cell line from a human cervical carcinoma known as HeLa (Helen Lane) cells. Dulbecco
developed plaque assay for animal viruses using confluent monolayers of cultured cells.
1954: Abercrombie observed contract inhibition: motility of diploid cells in monolayer culture ceases when contact is
made with adjacent cells.
1955: Eagle studied the nutrient requirements of selected cells in culture and established the first widely used chemically
defined medium.
1961: Hay flick and Moorhead isolated human fibroblasts (WI-38) and showed that they have a finite life-span in culture.
1964: Littlefield introduced the HAT medium for cell selection.
1965: Ham introduced the first serum-free medium which was able to support the growth of some cells.
1965: Harris and Watkins were able to fuse human and mouse cells by the use of a virus.
1975: Kohler and Milstein produced the first hybridoma capable of secreting a monoclonal antibody.
1978: Sato established the basis for the development of serum-free media from cocktails of hormones and growth factors.
1982: Human insulin became the first recombinant protein to be licensed as a therapeutic agent.
1985: Human growth hormones produced from recombinant bacteria was accepted for therapeutic use.
1986: Lymphoblastoidy γlFN licensed.
1987: Tissue-type plasminogen activator (tPA) from recombinant animal cells became commercially available.
1989: Recombinant erythropoietin in trial.
1990: Recombinant products in clinical trial (HBsAG, factor VIII, HIVgp120, CD4, GM-CSF, EGF, mAbs, IL-2).
Historický pohled na živočišné tkáňové kultury
Porovnání bakteriálních
a živočišných kultur
Výhody bakteriálních buněk
• Robustní reprodukovatelný systém
• Levná média
• Rychle rostoucí
• Vysoká produktivita (produkce proteinů)
Nevýhody bakteriálních kultur
• Intracellulární lokalizace produktů
• Kontaminace endotoxiny (nutná purifikace)
• Absence posttranslačních modifikací
• Absolutní nemožnost adresovat
mezibuněčnou a orgánovou komunikaci
• Omezené možnosti adresovat řízení
buněčného cyklu vícebuněčného organizmu
E.coli Mouse fibroblast
Human lymphocytes
Porovnání bakteriálních
a živočišných kultur
E.coli Mouse fibroblast
Nevýhody živočišných kultur
- Zisk tkáně (etika a dostupnost)
- Finanční náročnost
- Řadu buněčných typů neumíme kultivovat
- Výtěžek - kontaktní inhibice
Bakterie rostou dokud mají živiny Živočišné buňky:
Vazbou kadherinu se aktivuje
kaskáda fosforylace až k RB
protinu, která vede k aktivaci
G1/S kontrolního bodu
buněčného cyklu a ke vstupu
do G0 fáze.. (v té je většina
buněk v tělech živočichů)
Srovnání živočišných kultur se zvířaty
Výhody:
1) Levnější a rychlejší a kvnantitativnější a eticky schůdnější (vyjímky), než práce se zvířaty
2) Srovnatelné posttranslační procesy s lidskou buňkou (fosforylace, glykosylace, sumoylace, ubiqvitinylace atd)
3) Mechanizmy účinku látek srovnatelné mezi savčími buňkami
Nevýhody:
Změna charakteristik v průběhu kultivace -
1) Vlivem nesrovnatelného selekčního tlaku s prostředím in vivo
2) Vlivem zkracování telomer
3) Vlivem mutačního tlaku v důsledku vysoké proliferace
První kultivace živočišné buňky – Ross G Harrison (1907)
Kultivace ve visící kapce.. část žabího embrya
I dnes se tato technika stále využívá.. např. kultivace organoidů..
Tepající embryonální tělíska
– srdeční organoidy
Pešlakol.,HeartVessels,2014
Dlouhodobá kultivace v lahvi.. Alexis Carrel
tkáňová kultura za slepičího embrya (asi slepičí fibroblasty)
…nasazena do lahne v roce 1912
…asepticky kultivována do roku 1946 (34 let!!!)
..proto v první polovině 20 století… přesvědčení, že se buňky mohou dělit při dodávání živin NEOMEZENĚ
... NIKOMU se nepodařilo experiment zopakovat
… a pak přišel Leonard Heyflick s jeho objevem…
Leonard Hayflick
Živočišné buňky mohou prodělat jen omezený počet buněčných dělení…
Lidské buňky od embrya … maximálně 48 - 50 generací (zkrácení cca 11kB DNA)
Maximální počet generací závisí na druhu, buněčném typu, věku zdrojového
organizmu
Hayflick and Moorhead, Exp Cell Res, 1961
Hayflickův limit
Leonard Haiflick
Bakteriální DNA (chromozom)
Replikovaná DNA identická..
..možnost replikace do nekonečna.
Eukaryotický chromozom
Lineární molekula – replikace ale musí někde začít..
Hayflickův limit
Zkracování telomer při replikaci DNA..
TA65.co.za
Zkrácené telomery jsou rozpoznány jako poškození DNA a aktivují kontrolní bod G2/S, který nepustí buňku do metafáze…
… spouští se program senescence
Mescape.com
Hayflickův limit
Dlouhodobá kultivace v lahvi.. Alexis Carrel
tkáňová kultura za slepičího embrya (asi slepičí fibroblasty)
…nasazena do lahne v roce 1912
…asepticky kultivována do roku 1946 (34 let!!!)
..proto v první polovině 20 století… přesvědčení, že se buňky mohou dělit při dodávání živin NEOMEZENĚ
... NIKOMU se nepodařilo experiment zopakovat
Jak je tedy možné, že Alexis Carrel dokázal kultivovat fibroblasty 34 let?
A) Byl to podvod B) Podařilo se mu kultivovat embryonální kmenové buňky C) vykultivoval imortalizovanou buněčnou linii
Primární tkáňové kultury
Sigma-Aldrich
Astrocyty
Chondrocyty
Hepatocyty
Adipocyty
Fibroblasty
Myofibroblasty
Synoviocyty
Kosterní svalovina
Myocyty
Kardiomyocyty
Melanocyty
Keratinocyty
Buňky vlasového folikulu
Melanocyty
Osteoblasty
Krevní buňky
Neurony
Kmenové buňky (nejsou omezeny zkracováním telomer)
Běžné typy živočišných tkáňových kultur
Primární kultury
Orgánové explantáty Disociované buňky
Buněčné linie
Imortalizované Kmenové buňky
heterogenní klonální
Kombinace = hybridomové linie
Buněčné kultury
Závislé na ukotvení – adhezivní (fibroblasty, hepatocyty, myocyty atd..)
Nezávislé na ukotvení – suspenzní (izolované z krve – např lymfocyty atd..)
(bez ukotvení umírají)
Vlastnost Primární kultura Buněčná linie
Biologická relevance High Low
Doba proliferace Omezená/konečná Neomezená/nekonečná
Heterogenita Střední až vysoká Minimální (klonální)
Genetická Integrita Ponechává si
genotyp původní
tkáně In Vivo
Genetický drift v důsledku
selekce
Snadnost použití Potřebuje
optimalizaci
Dobře definovaná média a
podmínky kultivace
Finanční a časová
náročnost
Pomalejší růst,
dražší
Rychlejší růst a levnější
Dostupnost lidských.. Minimální - žádná Velké množství
Běžné typy živočišných tkáňových kultur
Srovnání primárních tkáňových kultur s buněčnými liniemi
disekce
disociace
Primární kultura Buněčná linie
Klonální selekce, imortalizace
Nádorová tkáň
Selekce
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
disekce
disociace
Primární kultura
Disociace
Mechanická (především měkké tkáně např. mozek, slezina atd..)
Enzymatická (Kolagenáza, Trypsin, další enzymy – většinou proteázy)
… a často jejich kombinace
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
• Buňky z mnoha orgánů je obtížné/nemožné získat
• Většina savčích buněk se in vitro nemnoží
• Kultivace naráží na Hayflickův limit
Human heart Craniotomy
Z těchto důvodů je využití primárních savčích, potažmo lidských kultur omezené..
Jak je možné překonat tato omezení?...
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
• Jednoduchý model složitých biologických systémů
• Biochemická a buněčná analýza savčích buněk vč. Člověka
• Odhalování savčích a lidských patologií
• Screening léčiv
• Jejich největší výhodou je jejich … imortalizace
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
Dissociated tissue
Clonal selection
1951
Henrietta Lacks
George and
Margaret Gey
HeLa cell line
(human negroid cervix epithel)
Merck
Karcinom děložního čípku
Geyova laboratoř testovala stovky rakovinných kultur, než objevili vysoce metaplastickou linii HeLa..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
Dissociated tissue
Clonal selection
1951
Henrietta Lacks
George and
Margaret Gey
HeLa cell line
(human negroid cervix epithel)
Merck
Karcinom děložního čípku
Geyova laboratoř testovala stovky rakovinných kultur, než objevili vysoce metaplastickou linii HeLa..Úspěchy dosažené s pomocí buněčné linie HeLa..
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Uměle vyvolaná imortalizace
Plicní epitel
Imortalizovaná linie
Znáte tkáň/buněčný typ a potřebujete buněčnou linii
(například pro studium SARS, nebo tvorbu vakcíny na COVID)
?
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Plicní epitel
Imortalizovaná linie
Znáte tkáň/buněčný typ a potřebujete buněčnou linii
(například pro studium SARS, nebo tvorbu vakcíny na COVID)
Uměle vyvolaná imortalizace
- Virovou indukcí
- Expresí hTERT
- Inaktivací tumor supresorových genů
Nejčastěji používané:
- geny EBV, HPV-16 E6/7
- Opičí Virus 40 (SV40) T antigen
Cílí tumorsupresorové geny P53, pRB,
nebo vyvolávají expresi telomerázy
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Plicní epitel
Imortalizovaná linie
Znáte tkáň/buněčný typ a potřebujete buněčnou linii
(například pro studium SARS, nebo tvorbu vakcíny na COVID)
Uměle vyvolaná imortalizace
- Virovou indukcí
- Expresí hTERT
- Inaktivací tumor supresorových genů
primární plicní epitel
… + sv40
… + sv40 + hTERT
Lundberg, Oncogene, 2002
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Plicní epitel
Imortalizovaná linie
Znáte tkáň/buněčný typ a potřebujete buněčnou linii
(například pro studium SARS, nebo tvorbu vakcíny na COVID)
Uměle vyvolaná imortalizace
- Virovou indukcí
- Expresí hTERT
- Inaktivací tumor supresorových genů
- Snížení exprese P53 a/nebo pRB
(stačí siRNA; v kombinaci s expresí hTERT)
- Řízená mutageneze genů Ras a Myc
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Imortalizovaná linie = nekonečně proliferující buněčná kultura..
Mutace DNA způsobující imortalizaci:
• Vzniklé in vivo (rakovinné linie)
• Uměle vyvolané
Uměle vyvolaná imortalizace
- Virovou indukcí
- Expresí hTERT
- Inaktivací tumor supresorových genůPlicní epitel
Primární kultura
biopsie
Imortalizovaná linie
…nebo si ji můžete koupit třeba jako linii 16HBE14o
…a amplifikovat na této kultuře coronavirus CoNV-19 (Sinovac, Sinopharm
imortalizace
Krátkodobé (primární tkáňové kultury)
Linie „nesmrtelné“
- Imortalizované linie
- Kmenové buňky
Živočišné kultury v biotechnologických procesech..
Kmenové buňky: kriteria a definice
Sebeobnova
Diferenciace
Schopnost vytvářet
vlastní kopie
Schopnost měnit
vlastnosti a funkčně
se specializovat
Klonální kapacita
•Symetrické dělení
•Asymetrické dělení
Toti
Pluri
Multi potence
Oligo
Uni
Kmenové buňky se sebeobnovují, množí
Sebeobnova = tzv. self-renewal; nejdůležitější vlastnost kmenových
buněk; schopnost vytvořit identické dceřiné buňky
Symetrické dělení Asymetrické dělení
Kombinace obou mechanismů = neurální KB !!!
Buněčná smrt
Embryonální KB Fetální a KB dospělého organizmu
(s vyjímkami)
Totipotentní/Pluripotentní buňky časného embrya
Zárodečné listy v embryonálním vývoji
Multipotentní buňky v embryonálním vývoji a progenitory dospělého jedince
Specializované buněčné typy se nemnoží a dále nediferencují
.... a diferencují a regenerují tkáně orgány
.... a diferencují a regenerují tkáně orgány
totipotence pluripotence multipotence oligopotence unipotence
zygota Embryonální KB Hematopoetické KB Gastrointestinální KB KB prostaty
CFU-GM
CFU-E & BFU-E
CD34
→
Neurony
Nediferencované KB
Příklady
Kolonie mnoha tisíc buněk
Pluripotentní kmenové buňky
One Ring to Rule Them All…
…nebo to mělo být:
One cell to rise them all…?
Co myslíme EMBRYEM, když mluvíme
O embryonálních kmenových buňkách
• preimplantační stádium
• blastocysta 4 dny stará
• tvoří ji několik desitek
buněk
• embryoblast a trofoblast
~9000 embryí implantováno (většinou po třech) ročně v ČR
zbytek >50% zůstane zamražen a …
"[T]he bottom line is that there are 400,000 frozen
embryos in the United States, and a large percentage of
those are going to be thrown out. Regardless of what
you think the moral status of those embryos is, it makes
sense to me that it's a better moral decision to use them
to help people than just to throw them out. It's a very
complex issue, but to me it boils down to that one
thing."
James Thompson
The destruction of human embryos to harvest stem cells
is "not only devoid of the light of God but is also devoid
of humanity" and "does not truly serve humanity."
Benedict XIV
Conrad Hal Wedington
Wedington epigenetic landscape
Diferenciace kmenových buněk
Diferenciace
– proces, při kterém nezralá buňka získá vlastnosti zralé specializované buňky
- epigenetický proces, při které se umlčuje exprese nepotřebných genů a naopak aktivuje exprese
genů, které vedou ke specializaci
- proces diferenciace je přirozeně nezvratný proces… viz kulička ve Wedingtonově krajině
Uměle (řízenou transkripcí specifických
transkripčních faktorů) umíme:
REPROGRAMOVAT TRANSDIFERENCIOVAT
Conrad Hal Wedington
Wedington epigenetic landscape
Diferenciace kmenových buněk
Diferenciace
– proces, při kterém nezralá buňka získá vlastnosti zralé specializované buňky
- epigenetický proces, při které se umlčuje exprese nepotřebných genů a naopak aktivuje exprese
genů, které vedou ke specializaci
- proces diferenciace je přirozeně nezvratný proces… viz kulička ve Wedingtonově krajině
Uměle (řízenou transkripcí specifických
transkripčních faktorů) umíme:
REPROGRAMOVAT TRANSDIFERENCIOVAT
Albert Lasker basic medical
research award 2009
Rudolf Jaenisch
Indukované pluripotentní KB (Yamanaka 2006)
Thy1 (a další geny typické pro fibroblasty))
0 4 8 12
retrovirová aktivita
markery pluripotentních KB
geny pluripotence
aktivita telomerázy
umlčení chromozomu X
Somatické buňky
Např. kožní fibroblasty
iPS buňky
Čas ve dnech
Stabilní reprogramace na “kmenovost”
Alternativní zdroj pluripotence - Indukované pluripotentní KB (iPS cells)
- KB vytvořené ze somatických tj. diferencovaných buněk pomocí genetické metody
Kinetika reprogramace fibroblastů do pluripotentních KB - relativně krátká cesta zpět
Oct4
Sox2
c-Myc
Klf4
iPS jsou schopny vytvořit chimérní organizmus
Oct-4 GFP
fibroblasty
Oct-4 GFP
iPS
Nanog GFP
iPS
Injekce chiméry
(bílá a hnědá srst)
Nanog GFP iPS chiméra Oct-4 GFP iPS chiméra
Brambrink et al. Cell Stem Cell, February 2008
Primitivní ektoderm/epiblast Trofektoderm
Polární trofektoderm
Extraembryonální ektoderm
Choriový ektoderm
Trofoblast placenty
Murální trofektoderm
Ektoplacentální konus
Obří buňky trofoblastu
placenta
parietální
žloutkový
váček
Primitivní entoderm
Ektoderm
• nervová tkáň – neurální KB
• kůže – kožní KB
Mesoderm
• kostní dřeň a krev – hematopoetické a mesenchymální KB
• svaly a kosti – tkáňově specifické KB
Entoderm
•plíce, játra, pankreas – orgánově specifické KB
• jícen, žaludek, střevo – intestinální KB
Viscerální entoderm
Parietální entoderm
embryonální KB
Původ a vývojová ontogeneze a osud kmenových buněk (KB)
Primordiální zárodečné buňky
• gamety
Preimplantační blastocysta
Myš-e4, člověk e5.-e6
Uhnízdění v děložní sliznici
Původ a vývojová ontogeneze a osud kmenových buněk (KB)
Primitivní ektoderm/epiblast Trofektoderm
Polární trofektoderm
Extraembryonální ektoderm
Choriový ektoderm
Trofoblast placenty
Murální trofektoderm
Ektoplacentální konus
Obří buňky trofoblastu
placenta
parietální
žloutkový
váček
Primitivní entoderm
Ektoderm
• nervová tkáň – neurální KB
• kůže – kožní KB
Mesoderm
• kostní dřeň a krev – hematopoetické a mesenchymální KB
• svaly a kosti – tkáňově specifické KB
Entoderm
•plíce, játra, pankreas – orgánově specifické KB
• jícen, žaludek, střevo – intestinální KB
Viscerální entoderm
Parietální entoderm
embryonální KB
Primordiální zárodečné buňky
• gamety
Preimplantační blastocysta
Myš-e4, člověk e5.-e6
Uhnízdění v děložní sliznici
Primitivní proužek e15-21
Chceme-li získat konkrétní buněčný typ, musíme napodobit embryonální vývoj
Thomas Graf & Tariq Enver Nature 462, 587-594 (2009) doi:10.1038/nature08533
Co řídí a určuje diferenciaci KB in vivo a in vitro:
Liniová diferenciace embryonálních kmenových buněk ve členité krajině vysokých
kopců (=NESTABILNÍ STAV BUNĚK), horských údolí (=RELATIVNĚ STABILNÍ ALE
REVERZIBILNÍ STAV BUNĚK) a hluboké nížiny (=TERMINÁLNÍ DIFERENCIACE BUNĚK)
Cesta je řízena transkripčními a růstovými factory a
Vede k celé řadě různých typů kmenových buněk..
Regulace osudu kmenové buňky epigenetickými mechanizmy: Sebeobnova a Diferenciace
Tvorba tkáně
Regenerace tkáně
Opravnémechanizmytkáně
Zdraváhomeostázatkáně
Metylace histonůMetylace DNA
Ubikvitinace a acetylace histonů Modifikace RNA a nekódující RNA
Kmenová buňka
Diferenciace
Sebeobnova
Působení na své okolí (mikroprostředí – niche)
Induced pluripotent stem cells
+ patient specific model
+ we know pathology on the level of organism
- undefined control standard
- possibly unknown polygenic or epigenetic factors
Myší
IVF leftover
4 days (mouse)
5-6 days (human)
Cultivation on feeder with:
Lif (mouse ES cells)
FGF2 (human ES cells)
Primokultura myších
embryonálních
fibroblastů
Mitotická
inaktivace
g-záření
foton
FGF2 +
Uměle vytvořené mikroprostředí pro udržení pluripotence - sebeobnovu
Myší fibroblasty mimikují trofoblast; bezsérové médium mimikuje prostředí blastocoelu; FGF2 mimikuje parakrinní signalizaci blastomer
(příště si povíme více o mikroprostředí – niche)
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Technologické zadání: Potřebujeme model srdce na testování arytmogenicity existujících léčiv
Pešl, Heart and Vessels, 2014
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Pešl, Heart and Vessels, 2014
BMP4 pomáhá
polarizaci embrya
při gastrulaci
(primitivní
mesendoderm)
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Pešl, Heart and Vessels, 2014
BMP4 pomáhá
polarizaci embrya
při gastrulaci
(primitivní
mesendoderm)
Hensenův uzel v
přítomnosti FGF2
spouští kardiogenezi
Activin A spouští
tvorbu
mezodermu
1mm
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Pešl, Heart and Vessels, 2014
BMP4 pomáhá
polarizaci embrya
při gastrulaci
(primitivní
mesendoderm)
Hensenův uzel v
přítomnosti FGF2
spouští kardiogenezi
Activin A spouští
tvorbu
mezodermu
VEGF is je
třeba pro
pozdní
morfogenezi
srdce (tvorba
komor)
1mm
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
IWR inhibuje Wnt
signál – zabrání
neurodiferenciaci
atp.
Pešl, Heart and Vessels, 2014
BMP4 pomáhá
polarizaci embrya
při gastrulaci
(primitivní
mesendoderm)
Hensenův uzel v
přítomnosti FGF2
spouští kardiogenezi
Activin A spouští
tvorbu
mezodermu
VEGF is je
třeba pro
pozdní
morfogenezi
srdce (tvorba
komor)
IWR inhibuje Wnt
signál – zabrání
neurodiferenciaci
atp.
Kardiomyocyty
začínají
spontánně bít
1mm
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Pešl, Heart and Vessels, 2014
Kardiomyocyty
začínají
spontánně bít
1mm
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
Biotechnologické aplikace
Tvorba „biosenzoru“ na detekci arytmogenni aktivity látek
MEA + Mikroskop atomárních sil + tepající srdeční organoidy
Pešl, Heart and Vessels, 2014
Kardiomyocyty
začínají
spontánně bít
1mm
DIFFERENCIACE PSC DO FUNKČNÍCH KARDIOMYOCYTŮ, aneb napodobujeme embryo…
• Funkční analýza v přítomnosti léčiv – precizní medicína
Biotechnologické aplikace
• Transplantace buněk
• Toxikologie
• a mnoho jiných…
Modely chorob z kmenových buněk:
- indukované pluripotentní kmenové buňky s mutací z pacienta
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Diferenciace in vitro
fibroblasts cardiomyocytes neurons
hiPSC
neurony
Můžete se těšit na příště – po hlavě do aplikací
Lekce II.: Aplikace živočišných tkáňových kultur
1. Vakcíny proti virovým onemocněním
2. Monoklonální protilátky
3. Rekombinantní glykoproteiny
4. Hormony a růstové faktory
5. Enzymy
6. Testování léčiv
7. Buněčná transplantace
8. Tkáňové inženýrství
9. Výroba organoidů a orgánů
Lekce III.:
Biotechnologické procesy
Živočišné tkáňové kultury a kmenové buňky
Konec I. bloku: Úvod do problematiky živočišných tkáňových kultur a kmenových buněk
Děkuji za pozornost..
Vladimír Rotrekl
vrotrekl@med.muni.cz