Osnova 2. přednášky
– protein-proteinové interakce (PPI)
• charakteristika PPI
• vliv post-translačních modifikací na PPI
• inhibice a modulace PPI
– sestavování proteinových komplexů
– typy komplexů (adaptéry, lešení …)
+
polá
hydrofob
rní
ní
primární
struktura
sekundární a terciární struktura
Minule: metody … moduly
DNA-proteinové
interakce
Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím
protein-proteinových interakcí
• Polypeptidový řetězec (primární struktura) má tendenci
vytvářet sekundární struktury -> terciární struktury -> kvarterní
tj. komplexy (stejné typy nekovalentních vazeb, minimální
energie - šroubovice a listy se k sobě skládají …)
• iontové, vodíkové, hydrofobní síly (kovalentní vazby disulfidické
můstky především u extracelularních proteinů)
• vodíkové můstky především u β-listů
Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím
hydrofobních protein-proteinových interakcí
- hydrofobní zbytky jsou tlačeny dovnitř proteinu (nikoli do solventu)
nebo do interakce (nejčastější způsob vazby)
– součet hydrofobních sil je značný (převažuje u většiny interakcí)
– hydrofobní povrchy se podílí na vytváření coiled-coil vláken
fa d
e
b
f
c
g
ad
c
g
f
e
b
Coiled-coil doména je
častým dimerizačním
modulem proteinů
Rui et al, RSC Chem Biol, 2023
- Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně:
proteiny musí mít komplementární tvar i charakter
- Variabilita je velká – nelze je jednoduše definovat obtížná
predikce (modelovat lze komplexy pro něž
existují již vyřešené struktury – AlphFold, CoZoId)
Typy protein-proteinových interakcí
doména-motif doména-doména
Furmanovaetal,BMCBioInf,2018
• stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů)
• přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání
signálů, modifikace)
• posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti
povrchu (fosforylace, metylace, SUMO)
• souhrn proteinových interakcí = interaktom
(modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén)
Network/síť naznačuje funkční vztahy
Tucker et al, TiCB, 2001
Seebacher & Gavin, Cell (SNAP SHOT), 2011
• stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů)
• přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání
signálů, modifikace)
• posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti
povrchu (fosforylace, metylace, hydroxylace, SUMO)
Protein-proteinové interakce
silné vs slabé interakce
Baderetal,FEBSLett,2008
- Interakční plocha 500-10 000A2 (vs pro ligandy 100-600A2)
- regulace PTM - vazba na fosfo-, acetyl …
- stabilní/komplexy
~350A2
- přechodné interakce
SH3 domény vážou prolin-rich (PxxP) peptidy (PDB: 4RTV)
- z analýzy protein-proteinových interakcí lze usuzovat na
potenciální stabilní komplexy vs přechodné interakce
- variabilita interakčních povrchů je velká => variabilita
PPI (nelze je jednoduše definovat)
S jakými partnery a jak silně interagují vaše proteiny?
Baderetal,FEBSLett,2008
interaktom
Nooren a Thornton, JMB, 2003
Perkins et al, Structure, 2010
vazebnou afinitu mohou výrazně ovlivnit PTM
nebo vazba ligandu (G-proteiny)
faktory ovlivňující
vznik a sílu vazby?
Modifikace může „vypnout/zapnout“ interakci
(viz též molekulární lepidla)
ATP … může ovlivnit přímo či nepřímo interakci
proteinů
… myosin+ADP váže aktin …
… vazba ATP na myosin disociuje vazbu s aktinem
… disociace ADP změní konformaci myosinu …
… myosinové hlavy hydrolyzují ATP na ADP …
… myosin+ADP znovu váže aktin …
(SMC komplexy – DNA loop extrusion …)
Protein-proteinové interakce jsou modulovány vazbou
GTP/GDP, ATP/ADP … G-proteiny spolu interagují s 1000x
nižší/vyšší afinitou za přítomnosti GDP než pokud je na Gα
navázané GTP (viz Ras) – dochází ke konformační změně
(dynamická)
Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005
GTP
Signální Ras dráha: EGF váže
EGFR … Ras může navázat GTP
(podobný Gα, ale monomer) a
interagovat s RAF kinasou - aktivuje
se MAPK dráha
rakovina – Ras mutace stabilizující
vazbu GTP mají za následek
konstitutivní aktivaci (aktivace i bez
EGF stimulu)
ATP/GTP, post-translační modifikace ... mění povrch (tvar,
náboj) – vytváří specifický nový povrch
- může blokovat nebo posílit vazbu partnera
Vliv PTM na PPI
Post-translační modifikace vytváří specifický nový povrch
specifické vazebné domény - např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě
vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu)
Modifikace AMK zbytek interakční doména
Fosforylace tyrosin SH2, PTB
serin/threonin 14-3-3, WD40, WW, BRCT…
acetylace lysin bromodoména
metylace lysin chromodoména
hydroxylace prolin VHL β
ubiquitinace lysin UIM, UBA, CUE
SUMOylace lysin SIM
Vliv PTM na PPI
SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr
a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) – změna tvaru i
náboje interakčního povrchu (PDB: 2PLD)
Wood et al, Nature, 2002
Výskyt „typických“ domén v různých organismech
Jaké domény obsahují vaše proteiny?
SH2 (a jiné) domény jsou často (jako moduly) součástí
proteinů rozmanitých funkcí – provazují proteiny mezi sebou
(přechodně, kondicionálně – regulace buněčných procesů)
Golemis a Adams, PPI, kniha
autoregulace
vazba substrátu
Signální Ras dráha: EGF váže EGFR (aktivuje
cytoplasmatickou kinasovou doménu = autofosforylace) – SH2
v GRB2 interaguje s EGFR - SH3 domény GRB2 dimerizují s
prolin-rich doménou SOS – EGFR-GRB2-SOS je aktivní (SOS
= guanin nukleotid exchange faktor) a odstraní GDP z Ras –
Ras může navázat GTP, uvolnit ze SOS a interagovat s RAF
kinasou - aktivuje se MAPK dráha
Post-translační modifikace vytváří specifický nový povrch
specifické vazebné domény - např. chromodoména váže metylované
peptidy – dvě domény HP1 váží metylované H3K9me (spojí 2 nukleosomy)
Modifikace AMK zbytek interakční doména
Fosforylace tyrosin SH2, PTB
serin/threonin 14-3-3, WD40, WW, BRCT…
acetylace lysin bromodoména
metylace lysin chromodoména
hydroxylace prolin VHL β
ubiquitinace lysin UIM, UBA, CUE
SUMOylace lysin SIM
Vliv PTM na PPI
Bottomley, EMBO rep., 2004
chromodoména HP1 navázaná na H3 lysin K9me – PDB: 1KNA
Bannister, Cell Res, 2011
Vliv PTM na PPI – histony H3 a H4
chromodoména HP1 navázaná na H3 lysin K9 – heterochromatin …
Ulrich a Takashi, Chromosoma, 2013
Ubikvitin–UBM…
SUMO–SIM…
SUMO – SIM
(krátký SIM motiv: [P/I/L/V/M/F/Y]-[I/L/V/M]-[D]-[L]-[T])
SUMO navázaná na SIM – PDB: 2MP2
Ivanov et al, TiPS, 2013
Ras dráha -
aktivace
- PPI předají
(viz
předchozí
slide)
Komplexy
(degradace
supresoru)
některé viry využívají buněčné PPI moduly k invazi do buněk (přesměrování
ve prospěch viru – vazba HPV-E6 na p53)
některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů (permanentní PPI)
Problémy inhibice (vývoje léků) …
- interakční plocha 500-10000A2 (větší než kapsy enzymů pro
malé ligandy)
- ploché bez hlubokých kapes (ne jako pro ligandy)
- hydrofobní charakter PPI (nerozpustnost léku)
- omezeně lze vycházet z přirozených ligandů
(jako u enzymů)
… ale
- interakce „peptid ve žlábku“ jsou relativně slabé
- lze inhibovat interakci i relativně malou molekulou (hot-spot)
- vhodné je cílení na interakce regulované
post-translační modifikací (viz fosfopeptidy)
- proteiny nebo mimikování peptidů
Inhibice PPI
Chevalieretal,Nature,2017
Hemaglutinin botulin(toxin)
5 topologií (dle známých inhibitorů)
40 AMK dlouhé (cca 200nt oligo) –
lze syntetizovat peptidy
(peptidy modifikovat)
NGS FACSorting
yeast surface display
Inhibice PPI - proteiny
GFP-
- mimikování peptidů:
sekundárních struktur α
sekundárních struktur β
Inhibice PPI – mimikování peptidů
Whitby a Boger, ACR, 2012
Labbe et al., NAR, 2015
Inhibice PPI: p53-MDM2
Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009
HP-E6
ubiquitination
MDM2-p53 (dimer, PDB: 1YCQ)
MDM2-nutlin (PDB: 4HG7)
- Inhibice interakce MDM2 stabilizuje p53 –
podpora nádorové suprese
jeden z prvních
Inhibice PPI: p53-MDM2
Ivanovetal,TiPS,2013
větší komplexy jsou stabilizovány více
interakcemi, ale může se rozpadnout/zablokovat i celý
komplex – např. otázka skládání komplexu
nová peptidomimetika
peptidomimetika
peptidomimetika
fosfopeptidová vazba
acetyl-peptidová vazba
kapsa pro ATP
FKBP12-FRAP-Rapamycin (KD = 12 nM)
Zpevnění PPI: molekulární lepidla
Choietal.,Science,1996
Ruietal,RSCChemBiol,2023
PDB: 1FAP
Konkávní povrchy
nezapadají – Rapamycin je
„vyplní“ (především FKBP12)
= spojí partnery k sobě
Změna konformace: molekulární lepidla
Rui et al, RSC Chem Biol, 2023
1. ligand posiluje PPI dvou proteinů
2. ligand dotváří povrch proteinu 1,
až poté se váže protein 2
add2. ligand může změnit povrch
proteinu 1, až poté se váže protein 2
… přerušení protein-proteinové
interakce je relativně snadné u
slabých dimerů – větší
komplexy jsou většinou
stabilizovány více interakcemi a
je tedy obtížnější je narušit
(mutací či inhibitorem) … pořadí
sestavování!
N
SE1
Nse3
M
AG
EG
1
NSE4
NSE2
SMC6 SMC5
… Stabilita komplexu je zpravidla větší než
pouhý součet jednotlivých protein-proteinových
interakcí mezi podjednotkami (větší povrch,
efekt přiblížení a zorientování partnera …)
Nse4
Pull-down
Kvasinkový 3Y2H
(2-hybridní systém)
wt
mut
Nse3
Proteinový
komplex
Nse4
Nse1
Palecek et al, JBC, 2006; Hudson et al, PLoS One, 2011
NSE2
SMC6 SMC5
L264F
P209L
WT
WT
NSE3
NSE3
TaylorE.M.etal.,MCB,2008
pokud schází podjednotka (ve stabilním komplexu), tak
nefunguje celý komplex – komplex se nesestaví nebo
rozpadá (nestabilní – degradace …)
Deplece kterékoli podjednotky
lidského komplexu má za
následek pokles hladiny
ostatních proteinů
mutace podjednotky držící
pohromadě komplex (narušila
Nse3-Nse4) může mít podobný
efekt ale …
vanderCrabbenetal.,JCI,2016
Mutanty – funkční příbuznost
A
B E
D
C
F
Proteinový
komplex
Genetické analýzy naznačují, že poškození jedné podjednotky (delece genu) komplexu
má za následek celý nefunkční proteinový komplex (nesestaví se nebo se rozpadá)
A
E
D
C
F
Delece jakékoli podjednotky má stejný efekt – i delece dvou podjednotek má
stejný efekt (nesčítá se)
Tendence sestavování komplexů „společně/najednou“ …
Jak se komplexy sestavují - homomery?
nejjednodušší (běžné) je sestavování homooligomerů
(homodimerů), ke kterému může docházet při translaci
tento toxin je
spíš vyjímka
- skládání je
iniciováno až na
místě (indukce)
Polypeptidový řetězec (primární struktura) vznikající na ribosomu
-> vytváří sekundární struktury -> terciární struktury -> kvarterní
tj. komplexy již během syntézy
Wellsaspol,BST,2015
Jak se komplexy sestavují - heteromery?
podjednotky se exprimují „nezávisle“ a pak se musí „potkat“
(trans-assembly model) – problém s nespecifickými
interakcemi, proteasami, „chaotické“ prostředí buňky …
… samostatně by se proteiny neposkládaly, byly by nestabilní
(degradace), toxické nebo by agregovaly (proteiny s
hydrofobními povrchy – interakce je skryje před solventem)
Shieh et al, Science, 2015
Jak se komplexy sestavují - heteromery?
podjednotky se exprimují „nezávisle“ a pak se musí „potkat“ trans-assembly
model …
transkripce genů u prokaryot je regulována operony: funkčně
vztažené geny/proteiny (komplexy) se transkribují z jednoho
operonu (tandemově uspořádané) – polycistronic mRNA –
ko-translace a ko-skládání (koordinované v prostoru i čase)
Shieh et al, Science, 2015
prokaryota
Shieh et al, Science, 2015
ze stejného
operonu
heterodimer luxA-luxB (luminiscenční komplex)
méně složených komplexů
ze stejného operonu,
ale stejné tagy
více komplexů složených ciskoexprimujte (v bakteriích) své proteiny i s partnery z jedné RNA!
prokaryota
FRET
„ribosome profiling“ – imunoprecipitace
jednoho proteinu „stahuje“ partnera i s
jeho RNA – pokud interagují už v
momentu translace, je zachycena i RNA interakční
povrch LuxA-LuxB koreluje s
RNA profily
LuxA
RNA
LuxB
RNA
AMK
55-65/
85-100
+ 30AMK/90nt uvnitř ribosomu
Shieh et al, Science, 2015
Podjednotky komplexů jsou ko-translatovány (eukaryota)
9 z 12 komplexů ko-translace
(ostatní 3 -speciální chaperony)
Shiber et al, Nature, 2018
Precipitace (ko-translace) byla „jednosměrná“,
tj. jedna podjednotka se vázala na RNA druhé
(nikoli naopak) – první byla stabilní, zatímco
druhá bez první agregovala (vazba na první
zajistila její stabilitu)
Mayr, Nature, 2018
Shiber et al, Nature, 2018
chaperon Hsp70/Ssb1 asociovaný s ribozomem – zajišťuje folding domény
(hydrofobní části) a poté se uvolní – pak se váže partner
?nejsou na stejné RNA – mechanismus není znám?
Bertolini et al, Science, 2023
Bertolini et al, Science, 2023
ko-translace a ko-assembly u eukaryot
nejčastěji ko-skládané komplexy dimerizovaly přes coiled-coil domény
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně
krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší
je méně stabilní a hůře se skládá)
– menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen
=> méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám –
odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší
podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury)
– komplexy mohou být dynamičtější (flexibilnější)
– evoluční výhoda modulů
(nový komplex vzniká
záměnou podjednotek)
bakteriální toxin
porin v mitochondrii
Mnoho proteinů obsahuje pouze interakční
domény a mají jediný úkol: nukleace
multiproteinových komplexů – scaffold
(lešení) – komplexy pak mohou být i
modulární – např. SCF (Skp-cullin-Fbox)
různé cullin nebo Fbox (adaptor) molekuly
(přednáška Dr. Kolesár)
Scaffold proteiny
Figure 3-79 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 3-79 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
SCF (Skp-cullin-Fbox) je modulární
– např. různé cullin (scaffold) nebo Fbox
(adaptor) molekuly
- různé komplexy rozeznávají různé
substráty (ubikvitinace)
- delece jednoho F-box proteinu/genu
eliminuje pouze subset substrátů
- delece jednoho cullin proteinu/genu
eliminuje větší spektrum substratů
- delece jednoho RBX (RING-finger)
proteinu/genu eliminuje většinu substratů
(je i více RBX podjednotek)
Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005
Network/interaktom SCF komplexů a jejich substrátů
Figure 3-82 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Závěry
• proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi
doménami – interakce mohou být modulovány
posttranslačními modifikacemi (dynamické komplexy)
• PTM (či jiná změna) může interakci posílit nebo oslabit –
asociace „podjednotky“ a modulace komplexu nebo
rozpad komplexu (či „odtržení“ podjednotky)
• stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet
jednotlivých protein-proteinových interakcí – záleží na
způsobu sestavování (pořadí sestavování)
• funkce celého „kompaktního“ komplexu je závislá na
každé podjednotce (komplex se nesestaví nebo
rozpadne bez všech podjednotek, „stabilnější“
podjednotky pomáhají skládání „labilnějších“
podjednotek – ko-translace)
• variabilita vzniká včleněním různých modulů do
komplexů - některé podjednotky mohou plnit funkci
lešení (scafold) nebo adaptérů