Separační vědy, jak je (ne)znáte Jiří Urban Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita E: urban@chemi.muni.cz | W: http://urban.chemi.muni.cz 2 Separační metody? 3 Separační metody https://glossary.periodni.com https://chemed.chem.purdue.edu Destilace Extrakce Filtrace https://education.seattlepi.com https://shutterstock.com Sublimace Inspirace: Jan Havliš Chromatografie 4 Co je to chromatografie? 5 Co s načatým večerem? + + Chromatografie Chromatografie χρώμα [chróma] – barva γραφειν [grafin] – psát Michail Semjonovič Cvět 1872 - 1919 Chromatografie χρώμα [chróma] – barva γραφειν [grafin] – psát Michail Semjonovič Cvět Martin Prince S03E10 1872 - 1919 12 Kapalinová chromatografie 13 Kapalinový chromatograf 1 – zásobník mobilní fáze 2 – odplyňovač mobilní fáze 3 – vysokotlaké čerpadlo 4 – dávkovač 5 – separační kolona 6 – termostat kolony 7 – detektor 8 – datová stanice 1 2 3 4 6 78 5 40 – 100 MPa 14 Vysokotlaká čerpadla Aplikace Průměr kolony Průtok Konvenční LC 4,6 mm 0,5 – 1,0 ml/min Mikrokolonová LC 1 mm – 500 µm 40 µl/min – 20 µl/min Kapilární LC 500 µm – 100 µm 20 µl/min – 300 nl/min Nano LC 100 µm – 75 µm – 50 µm 300 nl/min – 180 nl/min – 80 nl/min Velkoobjemová stříkačka Pístové čerpadlo 30 – 120 MPa, odolnost vůči korozi, stabilní a reprodukovatelný průtok < 0,5 – 1% 15 Nanášení vzorku – Dávkování ̶ Nutno překonat protitlak mobilní fáze (40 – 100 MPa) ̶ Automatické dávkovače (úprava vzorku, derivatizace,…) Vnější smyčka Vnitřní smyčka “Bez protitlaku” “S protitlakem” 16 Chromatografická kolona Délka, průměr, velikost částic www.prozyme.com www.chromnet.net Konvenční LC Mikrokolonová LC Kapilární LC Nano LC 4.6 mm 1 mm – 500 µm 500 µm – 100 µm 100 µm – 50 µm Velikost částicPorozita www.chromatographyshop.com Tvar částic www.analytical-sales.com Silikagel Porézní oxid křemičitý, SiO2 www.silicycle.com 17 Detekce jednotlivých analytů Detektor ̶ hmotnostní (HPLC/MS) ̶ spektrofotometrický (UV – Vis) ̶ fluorimetrický ̶ elektrochemický ̶ vodivostní ̶ rozptyl světla 18 Separace www.analytical-sales.com www.amazon.co.uk 19 Separace www.analytical-sales.com www.amazon.co.uk 20 Jak chromatografie funguje? 21 Aneb co má Usain Bolt společného s chromatografií? Princip chromatografie Podívej, chromatografie! 22 23 Separace – Rozdělení 9.58 s 16. srpen 2009 Mistrovství světa v atletice, Berlín Usain Bolt 24 Chromatografické interakce Stacionární fáze Mobilní fázeVzorek 25 Chromatografické interakce Stacionární fáze Mobilní fáze Vzorek 12 3 26 Chromatografické interakce Stacionární fáze Mobilní fáze Vzorek 12 3 Neustálé ustalování rovnováhy mezi fázemi 27 Chromatografické interakce Stacionární fáze Mobilní fáze Vzorek 12 3 Neustálé ustalování rovnováhy mezi fázemi Míra interakcí je ovlivněna polaritou vzorku a obou fází Platí pro nejrošířenějsí retenční mechanismy 28 Co je polárnější Fenol Toluen 29 Co je polárnější Fenol Toluen > Voda Hexan Polarita ≈ Rozdíl elektronegativity jednotlivých atomů 30 Seřaďte podle polarity Uracil Thiomočovina Fenol Toluen Ethylbenzen Propylbenzen Butylbenzen 31 Seřaďte podle polarity Uracil Thiomočovina Fenol Toluen Ethylbenzen Propylbenzen Butylbenzen NEPOLÁRNÍ POLÁRNÍ 32 Retenční mechanismy Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ POLÁRNÍ POLÁRNÍ NEPOLÁRNÍ NEPOLÁRNÍ POLÁRNÍ 33 Retenční mechanismy Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ POLÁRNÍ POLÁRNÍ NEPOLÁRNÍ NEPOLÁRNÍ POLÁRNÍ NORMÁLNÍ FÁZE OBRÁCENÉ FÁZE HYDROFILNÍ INTERAKCE 34 Normální fáze (Normal Phase, NP) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ NEPOLÁRNÍNORMÁLNÍ FÁZE www.silicycle.com, www.agc.com Porézní forma oxidu křemičitého (SiO2) Silikagel Hexan, Heptan s přídavkem izopropanolu, ̶ Izomery (tokoferol) ̶ Cukry ̶ Ve vodě nestabilní látky 35 Normální fáze (Normal Phase, NP) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ NEPOLÁRNÍNORMÁLNÍ FÁZE Similia similibus solvuntur. Podobné v podobném se rozpouští. Pořadí eluce Nepolární Polární 36 Obrácené fáze (Reversed-Phase, RP) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍNEPOLÁRNÍ OBRÁCENÉ FÁZE www.biocomma.com Chemicky vázané fáze -C4, -C8, -C18 Acetonitril Metanol Tetrahydrofuran Voda ̶ 70 – 80 % všech aplikací ̶ Lékařství ̶ Životní prostředí ̶ Průmysl ̶ … 37 Obrácené fáze (Reversed-Phase, RP) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍNEPOLÁRNÍ OBRÁCENÉ FÁZE www.biocomma.com Similia similibus solvuntur. Podobné v podobném se rozpouští. Pořadí eluce Polární Nepolární 38 Hydrofilní interakce (HILIC) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ POLÁRNÍHYDROFILNÍ INTERAKCE Acetonitril Metanol Voda/Pufr (nízké koncentrace) www.merckmillipore.com Interakce ve vodné vrstvě ̶ Lékařství ̶ Životní prostředí 39 Hydrofilní interakce (HILIC) Stacionární fáze Mobilní fáze POLÁRNÍ POLÁRNÍHYDROFILNÍ INTERAKCE Similia similibus solvuntur. Podobné v podobném se rozpouští. Pořadí eluce Nepolární Polární 40 Srovnání retenčních mechanismů Normální fáze Obrácené fáze HILIC Stacionární fáze Polární Nepolární Polární Mobilní fáze Nepolární Polární Polární Vzorky Méně polární Ne/Polární Polární 41 Monolitické stacionární fáze 42 Stacionární fáze https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460688 Sférické částice 43 Stacionární fáze https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460688 Sférické částice Monolitické stacionární fáze https://doi.org/10.1002/jssc.201901331 https://doi.org/10.1016/S0165-9936(02)00304-7 44 Světové monolity www.crystalinks.comPeter Polichronis 45 Světové monolity www.crystalinks.comPeter Polichronis https://www.studentagencybus.com 46 Monolitické stacionární fáze Anorganické Polymerní 47 Monolitické stacionární fáze Anorganické Polymerní 48 Polymerní monolity Metakrylátové Styren-divinylbenzenové glycidyl metakrylát ethylen dimetakrylát 1,4-butandiol 1-propanol styren divinylbenzen toluen 1-dodekanol azobisisobutyronitril benzofenon vinylbenzyl chlorid 49 Polymerační reakce www.vicijour.com www.fishersci.se T, t 50 Polymerační reakce www.vicijour.com www.fishersci.se T, t 51 Monolitické kapilární kolony 30% 29% 28% 10.1002/jssc.200301498 Vliv koncentrace 1,4-butandiolu v polymerační směsi 50 – 320 mm 52 Snadná modifikace Metakrylátové Styren-divinylbenzenové glycidyl metakrylát ethylen dimetakrylát 1,4-butandiol 1-propanol styren divinylbenzen toluen 1-dodekanol azobisisobutyronitril benzofenon vinylbenzyl chlorid Povrchová UV polymerace SN SN 53 Chemická modifikace Glycidyl metakrylát Vinylbenzyl chlorid Polymer 48 (2007) 2187 – 2198. 54 Roubování (Grafting) 1. krok 2. krok Stacionární fáze Neurotransmitery Barbituráty Fenolické kyseliny Tryptický digest Peptidy Polystyreny 56 Extrakce a separace Multifunkční kapilární kolona nízké pH vysoké pH Selektivní záchyt Separace Kyselina vinylphenyl boritá 2 - Epinefrin 1 - Normetanefrin 4 - Dopamin 3 - Norepinefrin Standardy Moč 57 Příprava vzorku pro proteomickou analýzu Proteolýza Záchyt fosfopeptidů 58 “Výroba” biodieselu Biotechnology and Bioengineering 109 (2012) 371 – 380. 59 Online LC-NMR Spojení s netradiční detekcí http://doi.org/10.1021/ac2010108 60 Miniaturizovaná elektrochemická detekce Integrované analytické systémy Uhlíkové vlákno, 7 mm Stříbrný mikrodrát, 25 mm http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2017.06.057 61 Integrované analytické systémy https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460537 62 Využití chromatografie 63 Analýza kávy https://doi.org/10.1016/j.jfca.2022.104841 Pražená káva Nepražená káva Bez kofeinu Analýza kafeinu a izomerů kyseliny chlorogenové 64 Kontrola kvality u medovin (?) https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2021.108737 Profil fenolických látek v medovině silně závisí na typu, množství a kvalitě použitého medu. Proto by mohl být použit pro kontrolu kvality jednotlivých vzorků. 65 Pijte černý bez Borůvka (Vaccinium myrtillus L., Vaccinium corymbosum L.), černý rybíz (Ribes nigrum L.), aronie (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott), černý bez (Sambucus ebulus L.), zimolez modrý (Lonicera caerulea L.) amalina (Rubus idaeus L.) https://doi.org/10.1007/s00216-022-04216-y 104 různých polyfenolických látek 66 67 Pijte černý bez Borůvka (Vaccinium myrtillus L., Vaccinium corymbosum L.), černý rybíz (Ribes nigrum L.), aronie (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott), černý bez (Sambucus ebulus L.), zimolez modrý (Lonicera caerulea L.) amalina (Rubus idaeus L.) https://doi.org/10.1007/s00216-022-04216-y 104 různých polyfenolických látek 68 Pesticidy v moči https://doi.org/10.1016/j.envint.2022.107452 69 Online analýza nervových přenašečů https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.02.011 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-415894-8.00024-5 70 -omics https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00319 71 Proteomická analýza https://doi.org/10.1159/000516764 Steven Carr at ResearchGate 72 Analýza jedné buňky (single-cell proteomics) https://doi.org/10.1016/j.tranon.2022.101556 73 Single-cell proteomics http://doi.org/10.15252/msb.202110798 74 -omics https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00319 75 Lipidomická analýza www.agilent.com 76 Lipidomická analýza Michal Holčapek, Univerzita Pardubice https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b01054 2015 Journal of Chromatography A, 858 (1999) 13–31 1999 sellugsk.live 77 Včasná diagnostika rakoviny slinivky https://doi.org/10.1038/s41467-021-27765-9 zdraví / nemocní 78 Včasná diagnostika rakoviny slinivky Lipidomické dráhy 79 Jiří Urban 80 Sky is the limit Jiří Urban