Výpočetní návrh stabilních proteinů
Miloš Musil
http://loschmidt.chemi.muni.cz/
Loschmidtovy laboratoře
2/47
Prof. Jiří Damborský
Z. Prokop D. Bednář M. Marek S. Mazurenko
1994
Co děláme...?
 Experimentální tým
 Charakterizace proteinů
 Řešení struktur
 Mikrofluidika
 Teoretický tým
 Molekulární dynamiky
 Bioinformatika
 Strojové učení
3/47
Naše nástroje
4/47
Proteiny
5/47
Léčiva
Biosenzory
Zemědělství
Biodegradace
Stabilní proteiny
 Stabilní proteiny jsou odolnější
 Odolnost proti mutacím
 Důležité během evoluce
6/47
Teplota Nepříznivé pH Rozpouštědla Životnost
Stabilita proteinů
 Silně spojena se strukturou proteinů
 Náhodné skládání není možné
 Struktura proteinu závisí pouze na sekvenci
 Způsobeno interakcemi mezi aminokyselinami
 Fyzikálně-chemické interakce
 Kovalentní vazby
 Nekovalentní interakce
7/47
Molekulární interakce
 Kovalentní interakce
 Sdílení elektronu
 Spojeno s primární strukturou
 Nekovaltentní interakce
 Elektrostatické interakce
 Polární interakce
 Nepolární interakce
 Spojeno se sekundární a terciální strukturou
8/47
Nekovalentní interakce
 Interakce mezi náboji
 Polární interakce
 Vodíkové můstky
 Aromatické interakce
 Nepolární interakce
 Van der Waalsovy interakce
 Hydrofobicita
9/47
Stabilita proteinů
 Obecně vzato reprezentováno změnou Gibbsovy
volné energie při skládání (ΔG)
10/47
Návrh stabilních mutantů
 Měřeno v ΔΔG nebo ΔTm
ΔΔ𝐺 = ∆𝐺 𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡 − ∆𝐺 𝑤𝑡
 Záporné ΔΔG značí vyšší stabilitu
 Jednobodové x vícebodové mutace
 Efekt na stabilitu
 Synergické, aditivní, antagonické efekty
11/47
Návrh stabilních mutantů
 Saturační mutageneze není možná
 Průměrný protein o 300 aminokyselinách dává téměř
6000 jednobodových mutací
 Nespočet potenciálních kombinací
 Nutnost výpočetních nástrojů
 Solidní přesnost (~ 70-75 %)
 Použitelné pro prioritizaci
12/47
Výpočetní metody
13/47
Strojové učení Silová pole Evoluce
Hybridní metody
Strojové učení
 Nejběžnější přístup
 Založeno na statistice a počítačových vědách
 Rozpoznání vzorů nad trénovacími daty
 S učením x bez učitele
 Klasifikace
 Shlukování
 Rozpoznání vzorů
14/47
Strojové učení
15/47
Silová pole
 Výpočet volné energie
 Založeno na (zjednodušených) zákonech fyziky
 Zvažuje různé fyzikální a biochemické parametry
 Fyzické x statistické potenciály
 Přesnost vs výpočetní nároky
 Statistické jsou založené na datech
 (Empirické potenciály)
16/47
Force-fields
17/47
Evoluce
 Návrhy založené na evoluci
 Využívá vícenásobné zarovnání sekvencí
 Analýza konzervovaných regionů
 Dva hlavní přístupy
 Ancestrální rekonstrukce
 Back-to-consensus
18/47
Evoluce
19/47
Hybridní metody
 Kombinace několika přístupů
 Evoluce použita jako filtr pro silová pole
 Použitelné pro návrh vícebodových mutantů
 Pouze hrstka dostupných nástrojů:
 FireProt
 PROSS
 FRESCO
20/47
Hybridní metody
21/47
Výpočetní nástroje
22/47
23/47
FireProt
 Plně automatizovaný návrh stabilních proteinů
 Dva hlavní přístupy
 Energetický (silová pole)
 Evoluční (BTC a ASR)
 Filtrování na základě sekvence
 Nástroj poskytuje několik vícebodových mutantů
 Uživatelské rozhraní
24/47
Schéma
25/47
Schéma
26/47
Výsledky
 Významná stabilizace DhaA, LinB a FGF2
 Další v literatuře
27/47
Uživatelské rozhraní
28/47
Uživatelské rozhraní
29/47
Uživatelské rozhraní
30/47
31/47
Ancestrální rekonstrukce
 Ancestrální proteiny -> stabilnější
 Náročné podmínky na Zemi
 Náhodné mutace během evoluce
 Bias způsobený konsenzem
 Několik kroků výpočtu
 Vyhledání homologních sekvencí
 MSA a konstrukce stromu
 Ancestrální rekonstrukce a mezery
 Vyžaduje expertní znalosti
32/47
FireProt-ASR
 Plně automatizovaná metoda pro ASR
 Výběr počátečního setu homologů
 Redukce datasetu
 MSA a konstrukce stromu
 Zakořenění a ancestrální rekonstrukce
 Doplněno interaktivním uživatelským rozhraním
 Vizualizace struktury
 Návrh nových ancestrálů
33/47
Schéma
 Hledání homologních sekvencí
 Redukce výchozích dat
 Konstrukce MSA a stromu
 Zakořenění použitím MAD
 Ancestrální rekonstruce s ML
 Rekonstrukce mezer
34/47
Výsledky
35/47
Results
 Zlepšení stability o 20 – 26 °C
 Zachování výtěžků a aktivity
36/47
Protein code
Expression
(%)
Solubility
(%)
Yield (mg/l) Tm (°C)
HLD act.
(μmol/mg·s)
LUC act.
(RLU/mg·s)
DhaA wt 17 83.1 91.1 50.56 ± 2.4 0.032 ± 0.006 n.a.
DhaA 172Loc 23 85.5 74.9 71.60 ± 0.7 0.038 ± 0.001 1.41 ± 0.26
DhaA
172Glob
21 65.2 88.2 70.04 ± 1.5 0.061 ± 0.005 n.a.
DhaA 230Loc 20 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
DhaA
230Glob
23 84.8 108.5 72.14 ± 0.4 0.061 ± 0.012 n.a.
DhaA 238Loc 23 63.2 74.9 70.36 ± 0.6 0.014 ± 0.002 353.5 ± 14.58
DhaA
238Glob
19 83.3 94.4 76.19 ± 0.2 0.030 ± 0.002 3.18 ± 0.33
Uživatelské rozhraní
37/47
Uživatelské rozhraní
38/47
Uživatelské rozhraní
39/47
40/47
FireProt-DB
 Databáze pro uchování stabilitních dat
 Přes 15,000 experimentů
 242 proteinů
 Sekvenční a strukturní predikce
 Interaktivní uživatelské rozhraní
 Pokročilé vyhledávání, statistiky, vizualizace, ...
41/47
Uživatelské rozhraní
42/47
43/47
HotSpot Wizard
 Identifikace reziduí pro mutagenezi
 Čtyři strategie proteinového inženýrství
 Funkcionální hotspoty
 Analýza flexibility
 Back-to-consensus
 Analýza korelovaných pozic
 Predikce vlivu mutací na funkci proteinu
44/47
Uživatelské rozhraní
45/47
Závěry
 Nutnost zlepšení stability proteinů
 Nákladné a zdlouhavé laboratorní experimenty
 FireProt: návrh stabilních mutantů
 FireProt-ASR: ancestrální rekonstrukce
 FireProt-DB: uchování stabilitních dat
 HotSpot Wizard: identifikace hotspotů
46/47
Poděkování
47/47