Analýza genomických
a proteomických dat
Mgr. Eva Budinská, Ph.D.
Jaro 2023
Technologie studující genomiku a proteomiku
Mikročipy (microarrays)
Průběh genomického experimentu
1. Příprava a provedení experimentu v
laboratoři
2. Extrakce a úprava dat
3. Statistická analýza dát4. Biologická a klinická interpretace
Technologie mikročipů
• Mikročipy– biotechnologie simultánně srovnávající biologické objekty (molekuly,
tkáně) na základě jejich imobilizace na jediný podklad do oblastí (spotů) které jsou
pravidelně uspořádány do řádků a sloupců
• Podklad: sklo, gel, parafin, ...
• Mikročipy v genomice a proteomice:
• DNA mikročipy
• Proteinové mikročipy
DNA mikročipy
• Serie krátkých DNA sekvencí imobilizovaných rovnoměrně na podklad, používaná
k detekci DNA nebo RNA (obvykle jako cDNA) ve vzorcích.
• Využití
• Měření změn v hladinách genové exprese (gene expression profiling, detekcia
RNA - cDNA) - expresní mikročipy
• detekce strukturních změn v genomu (SNPs- jednonukleotidové polymorfismy
nebo změny v počtu kopií genů) – arrayCGH, SNP arrays
• detekci vazebních míst proteinů na genomu (ChIP-on-chip)
• detekci alternativního sestřihu (exon junction arrays)
• přesná detekce neznámých a nepredikovaných transkriptů (tiling arrays)
Sonda (probe)
• Krátké sekvence DNA (oligonukleotidy) na mikročipu se nazývají sondy, anglicky
probes
• Každá oblast DNA (obvykle gen), kterou chceme zkoumat
• Sondy jsou navrženy tak, aby byly pro daný gen / oblast co nejspecifičtější
Základní princip
1. Fragmenty DNA / cDNA ze vzorku se spárují s komplementárními sondami na mikročipu a
tím se mobilizují.
2. Imobilizované molekuly DNA, které byly dříve označeny fluorescenčním barvivem se pak
dají detekovat pomocí UV skeneru a kvantifikovat tak množství mRNA / DNA s danou sekvencí
přítomné ve vzorku.
Postup mikročipového experimentu
1. Výroba mikročipového sklíčka
2. Příprava vzorků
3. Hybridizace
4. Skenování
5. Analýza obrazu (kvantifikace signálu, vznik expresních dat)
Příprava čipu a vzorků
Vznik dat
Postup mikročipového experimentu
1. Výroba mikročipového sklíčka
2. Příprava vzorků
3. Hybridizace
4. Skenování
5. Analýza obrazu (kvantifikace signálu, vznik expresních dat)
Příprava čipu a vzorků
Vznik dat
Princip výroby DNA mikročipu
• Výroba sklíčka spočívá v připojení sond na podložné sklíčko do oblastí spotů
• Dvě hlavní metody:
• Spotting – sondy jsou syntetizované PŘED umístěním na microarray sklíčko,
potom umístěné na sklíčko pomocí speciálního robota
Spotovací robot
J. Vallon-Christersson, Dept Oncology, Lund Univ.
Princip spotování
http://www.youtube.com/watch?v=Pjr1Oyc0KrY&feature=relate
d
Princip výroby DNA mikročipu
• Výroba sklíčka spočívá v připojení sond na podložné sklíčko do oblastí spotů
• Dvě hlavní metody:
• Spotting – sondy jsou syntetizované PŘED umístěním na microarray sklíčko,
potom umístěné na sklíčko pomocí speciálního robota
• In-situ syntéza – sondy jsou syntetizované přímo na podklad, fotolitografickou
syntézou
• http://www.youtube.com/watch?v=ui4BOtwJEXs&feature=related
• Spotting – u delších cDNA sekvencí
• In-situ syntéza – pro krátké oligonukleotidy
Typy sond
• cDNA sondy - 500-5000 párů bazí dlouhé cDNA klony cílového genu nebo známé
sekvence. Obvykle syntetizované před umístěním na microarray sklíčko pomocí
spotovacího robota
• Výhoda: jsou více specifické, a v případě úspěšné hybridizace s cílovou DNA
můžeme téměř s jistotou říct, že se spojily právě s daným genem
• Oligonukleotidové sondy – maximálně 25 párů bazí dlouhé sekvence, které jsou
designované tak, aby odpovídaly jen částem sekvence známých kódujících genových
ORF (open reading frames).
Typ mikročipů dle typu sondy
• Podle typu sondy rozlišujeme:
• cDNA mikročipy – používají cDNAsondu
• hybridizace závislá na délce sond
• neznáme přesný počet klonů v každém spotu
• hybridizaci nutno stanovit relativně (k referenci). Tato relativní informace je
robustnější než absolutní informace o intenzitě každého spotu. Proto jsou tyto
experimenty obvykle dvoukanálové (jeden kanál pro DNA, kterou zkoumáme,
druhý kanál pro referenční DNA).
• Oligonukleotidovémikročipy – oligonukleotidové sondy, obvykle syntetizované in-
situ
• známe přesný počet klonů
• stejná délka sondy
• není nutná reference, proto jsou jednokanálové (jeden vzorek na čip bez
reference).
Postup mikročipového experimentu
1. Výroba mikročipového sklíčka
2. Příprava vzorků
3. Hybridizace
4. Skenování
5. Analýza obrazu (kvantifikace signálu, vznik expresních dat)
Příprava čipu a vzorků
Vznik dat
Příprava vzorků
1. Izolace DNA/RNA: molekuly které chceme zkoumat (DNA či mRNA) jsou
extrahované ze vzorku.
2. Přepis a amplifikace: mRNA se přepisuje do cDNA a amplifikuje se
pomocí RT-PCR. DNA zas pomocí PCR.
mRNA
A
G
C U
RT-PCR
A
G
C T
cDNA
DNA
A
G
C T
PCR
A
G
C T
DNA
Příprava vzorků
3. Značení: Amplifikovaná DNA (cDNA) je obarvená fluorescenčním barvivem
(nejčastěji Cy3 nebo Cy5). Toto s nazývá přímé označení. U nepřímého značení
nejdříve skupina, většinou primární amin je inkorporovaná do cDNA a Cy3/Cy5
jsou potom inkorporované do cDNA při následné reakci.
Postup mikročipového experimentu
1. Výroba mikročipového sklíčka
2. Příprava vzorků
3. Hybridizace
4. Skenování
5. Analýza obrazu (kvantifikace signálu, vznik expresních dat)
Příprava čipu a vzorků
Vznik dat
Hybridizace DNA
• DNA mikročipová technologie je
založená na hybridizaci
• Hybridizace je proces
komplementárního párování
dvou jednořetězcových
nukleových kyselin do
dvouřetězcové molekuly
(duplexu) na základě párování
bazí.
Hybridizace na mikročipu
1. Fragmentovaná a namnožená cDNA(DNA) vzorku se nanese na mikročipové sklíčko,kde už jsou
předem navázané jednořetězcové sondy.
2-. Zahřátím na určitou teplotu se zruší vodíkové vazby mezi řetězci a DNA vzorku se rozplétá na dva
samostatné řetězce – tento proces nazýváme denaturace.
3. Teplotase zase sníží a jednořetězcové molekuly se snaží znovu spárovat se svými
komplementárnímiřetězci
4. Nastává komplementární párování mezi:
- původním párem DNA řetězců
- DNA a sondou – vzniká hybrid
5. Sklíčko se nakonec omyje a
zůstanou pouze hybridizované řetězce.
Zdroj: http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2008/mb/b713259j
Vznik a vlastnosti mikročipových dat
Postup mikročipového experimentu
1. Výroba mikročipového sklíčka
2. Příprava vzorků
3. Hybridizace
4. Skenování
5. Analýza obrazu (kvantifikace signálu, vznik expresních dat)
Příprava čipu a vzorků
Vznik dat
Vznik a charakter dat
Každá technologie má svůj vlastní způsob kvantifikace signálu (teda proměny signálu
na čísla – data).
Mnohé principy jsou společné.
1. Fluorescenčnísignál je excitován s pomocí laseru
2. Elektrony jsou zachycené mikroskopem přes filtry do obrazu
3. Tyto obrazová data se kvantifikují
Vznik a vlastnosti mikročipových dat ->
cDNA mikročipy
F. Analýza obrazu
(snímání intenzit
jednotlivých kanálů)
Datový soubor:
tisíce řádků (genů) X
desítky sloupců
- číselné hodnoty intenzit
testované a referenční RNA
(+ hodnoty pozadí... )
- kontrola kvality spotů
- ...
spot
Další analýza
1. úpravy datového souboru
2. určení odlišných genů
3. klasifikace, predikce....
Jak získáváme základní data z cDNA
Dvoukanálové skenování
Po hybridizaci vkládáme sklíčko do skeneru abychom vytvořili obrázek
mikročipu.

Vyšší frekvence,
více energie

Nižší frekvence,
méně energie
Ozáření
„zelená“
vlnová
délka
fluorescence
Překrytí obrazů
„červená“
vlnová
délka
Vlnová délka (, nm)
Excitační a emisní spektra Cy3 a Cy5
Analýza obrazu
Kroky kvantifikace:
1. Lokalizace center spotů Automaticky
pomocí grid (síťky), a manuální úpravou
2. Segmentace
Klasifikace spotů, odlišené intenzity pozadí
od popředí (pomocí kruhů, etc...).
3. Kvantifikace signálu
V popředí i v pozadí spotu
Terry Speed et al.
Po skenování se uloží obrázek mikročipového sklíčka ve formátu .tiff, který se vloží do
programu pro analýzu obrazu. Následuje kvantifikace signálu.
Lokalizace center spotů
Terry Speed et al.
Automaticky pomocí speciálního souboru grid (od výrobců mikročipu),
který obsahuje informaci o:
• Počtu a umístění spotů na mikročipu
• Průměru spotů v pixelech
Segmentace
▪ V tomto kroku jsou programem pro analýzu obrazu rozpoznávané
oblasti spotů a pozadí
▪ Nastavení velikosti a pozice spotů – probíhá nejprve automaticky
▪ Obvykle nutná vizuální inspekce a další přizpůsobení ručně
▪ Navíc – nutné manuální označování špatných, případně prázdných
spotů
▪ Nejčastější algoritmy vyhledávání spotů:
▪ Fixed circles
▪ Adaptive circles
▪ Histogram adaptive
▪ Různé programy různě definují pozadí spotu
GenePix
QuantArray
ScanAlyse
Kvantifikace signálu
▪ V této fázi se kvantifikuje signál spotu, používají se různé charakteristiky
(průměr, medián, modus, kvantily)
Průměr
Medián
Modus
75% kvantil
Logaritmus intensity signálu v pixelech spotu
Kvantifikace signálu pozadí
GenePix QuantArray ScanAlyse
• Tři druhy metod:
1. Lokální metoda(local background)
2. Morfologické otevření (morphological opening)
3. Konstantní/globálnímetoda (constant/global background)
Vizualizace oblastí lokálního odhadu intenzity pozadí u tří
různých programů analýzy obrazu cDNA mikročipu
Kvantifikace signálu pozadí 2.
Čtvercový element Nový obraz
s odhadnutým
signálem pozadí
Schematické znázornění
Center spotů, ze kterých
je odhadnutý
signál pozadí pro spot
• Tři druhy metod:
1. Lokální metoda (local background)
2. Morfologické otevření (morphological opening)
3. Konstantní/globálnímetoda (constant/global background)
Kvantifikace signálu pozadí 3.
• Tři druhy metod:
1. Lokální metoda (local background)
2. Morfologické otevření (morphological opening)
3. Konstantní/globální metoda (constant/global background)
Signál je odhadnutý jako jediná hodnota pro všechny spoty:
• Jako průměr intenzit signálů negativních kontrol (sondy jiného
organismu, které by neměly hybridizovat se vzorkem)
• Nebo jako 3% kvantil rozdělení signálu všech spotů
Kontrola kvality spotů I.
• Po dobu kvantifikace intenzit probíhá ještě inspekce kvality spotů na základě
parametrů zadaných do algoritmu
• I po kvantifikaci je možné manuálně označit spoty, které považujeme za
nekvalitní
• Spotům, které neprojdou kontrolou kvality je přiřazená příslušná hodnota v
proměnné Flags:
• Např.
• 100 ~ good ;
• -100 ~ bad ;
• -75 ~ absent;
• -50 ~ not found;
• 0 ~ unflagged;
Source: http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/2/images/g002230.gif
Kontrola kvality spotů II.
Charakteristiky kontroly kvality:
• Velikost a tvar spotu
• Příliš malé spoty neposkytují věrohodné odhady intensity hybridizace (Simon et
al., 2003) (spoty menší než < 25 pixelů by měly být odstraněné)
• Spoty s nepravidelným tvarem, případně "koblihové spoty" by měly být označené
jako nekvalitní
• Intensitasignálu
• Spoty s příliš malou intenzitou signálu v obou kanálech
• log2(610/590) = 0.048, ale log2(30/10) = 1.58
• Poměr signál/šum by měl být dostatečně velký
• Nasycení (saturace) spotu
• Spoty by neměly obsahovat nasycené pixely!
Kontrola kvality spotů III.
Příklady nekvalitních spotů (A-C) v porovnání s ideálním spotem (D)
A) nasycený (saturovaný) spot, B) koblihový spot, C) spot s nepravidelnou
strukturou, D) dobrý spot
Ukázka základních cDNA mikročipových dat
Data z jednoho cDNAmikročipového sklíčka
Po kvantifikaci a kontrole získáváme základní datový soubor.
Základní datový soubor
Obsahuje (příklad GenePix 6.0)
• Pozice spotu
• Jméno a další identifikátory sondy na spotu
• Další charakteristiky spotu: (průměr, tvar, cirkularita, saturace, ...)
• Informace o intenzitě signálu pozadí, popředí (medián, průměr, suma, SD)
• Počet saturovaných pixelů
• Odvozené charakteristiky
• i) % pixelů signálu s intenzitami většími než 1SD (2SD) intenzity pozadí
• ii) intenzita signálu mínus intenzita pozadí
• iii) poměr mediánů/průměrů obou kanálů
• iv) logaritmus báze 2 tohoto poměru
• Informace o kvalitě spotu
• Proměnnou Flags
Základní data
• Data v základním souboru NEJSOU koncentrace mRNA!
• Hodnoty získané z microarray experimentu jsou pozitivně korelované s množstvím
přítomné mRNA, ale navíc v sobě nesou ŠUM, související s:
• Kontaminací tkaniva
• RNA degradací
• Efektivitou
• amplifikace DNA
• reverzní transkripce
• hybridizace a specificitou sond
• Výběrem a identifikací sond
• PCR výsledkem
• NUTNÁ KONTROLAKVALITYA ÚPRAVA DAT
• Efektivitou spotování
• Dalšími technickými vlivy při
zpracování
• Segmentací obrazu
• Kvantifikací signálu
• Korekcí na pozadí
Podívejme se na reálná data!
V učebních materiálech k předmětu naleznete soubor cDNApriklad.zip
Soubor stáhněte a rozbalte.
Struktura adresáře:
raw/
cDNA.R
E-GEOD-45596.idf.txt
E-GEOD-45596.sdrf.txt
SampleInfo.txt
Vyberte jeden ze souborů z adresáře raw/ a otevřete ho v EXCELu
GSM1110303_Texas_Tech_251485034901_S01_GE2-v5_91_0806_1_1.txt
GSM1110304_Texas_Tech_251485036824_S01_GE2-v5_91_0806_1_1.txt
GSM1110305_Texas_Tech_251485034901_S01_GE2-v5_91_0806_1_2.txt
GSM1110306_Texas_Tech_251485036824_S01_GE2-v5_91_0806_1_2.txt
...