Výuka IBA Analýza genomických a proteomických dat cDNA mikročipy - Kontrola kvality a normalizace Jaro 2023 6. a 13. březen 2024 Eva Budinská (eva.budinska@recetox.muni.cz) cDNA mikročipy – kontrola kvality Úrovně kontroly kvality Úroveň sondy: Kvalita jednoho spotu na mikročipu Úroveň mikročipu: Kvalita celého mikročipu Úroveň experimentu: Kvalita měření transkriptu všech mikročipů v experimentu Mikročipy 1 ... n Kvalita mikročipu Kvalita experimentu Kvalita sondy Úroveň mikročipu (základní datová matice) Úroveň experimentu (finální datová matice) Úrovně úpravy datových souborů Mikročipy 1 ... n Kvalita mikročipu Kvalita experimentu Kvalita sondy Úroveň mikročipu (základní datová matice) Úroveň experimentu (finální datová matice) Odstranění nekvalitních spotů Sumarizace duplikátů Normalizace uvnitř mikročipu Normalizace mezi mikročipy Úroveň sondy: Kvalita jednoho spotu na mikročipu Úroveň mikročipu: Kvalita celého mikročipu Úroveň experimentu: Kvalita měření transkriptu všech mikročipů v experimentu Úrovně úpravy datových souborů Mikročipy 1 ... n Kvalita mikročipu Kvalita experimentu Kvalita sondy Úroveň mikročipu (základní datová matice) Úroveň experimentu (finální datová matice) Odstranění nekvalitních spotů Sumarizace duplikátů Normalizace uvnitř mikročipu Normalizace mezi mikročipy Úroveň sondy: Kvalita jednoho spotu na mikročipu Úroveň mikročipu: Kvalita celého mikročipu Úroveň experimentu: Kvalita měření transkriptu všech mikročipů v experimentu Kontrola dat v rámci mikročipového sklíčka •Replikáty sond •Sumární statistiky replikátů spotů (nekvalitní spoty už vyloučené) Buď odstranit sondy s příliš velkou variabilitou mezi replikáty… –…nebo si uschovat informaci o počtu validních replikátů (a vyhodit klony jen s jedním replikátem) Kvalita mikročipového sklíčka –Procento nekvalitních spotů nesmí být příliš velké (<25 %) •Systematické odchylky odstraníme procesem NORMALIZACE Úrovně úpravy datových souborů Mikročipy 1 ... n Kvalita mikročipu Kvalita experimentu Kvalita sondy Úroveň mikročipu (základní datová matice) Úroveň experimentu (finální datová matice) Odstranění nekvalitních spotů Sumarizace duplikátů Normalizace uvnitř mikročipu Normalizace mezi mikročipy Úroveň sondy: Kvalita jednoho spotu na mikročipu Úroveň mikročipu: Kvalita celého mikročipu Úroveň experimentu: Kvalita měření transkriptu všech mikročipů v experimentu Systematické odchylky uvnitř mikročipu §Nerovnoměrná hybridizace (prostorové odchylky) §Příčina: nerovnoměrně umytý čip, nerovnoměrně distribuovaný vzorek, print-tip efekt (defektní jehla) §Signál pozadí (background) §Může být velmi silný, buď špatně umytý čip, nebo špatná segmentace (část popředí je kvantifikovaná jako pozadí) §Efekt barviva (rozdíly intenzit mezi kanály) §Příčina: odlišná schopnost inkorporace molekul barviva (Cy3, Cy5) odlišná reakce na excitaci (slabší intenzita UV, ...) ODHALUJEME GRAFICKOU REPREZENTACÍ DAT Virtuální rekonstrukce mikročipu, vykreslení heatmapy log2 poměru Cy5/Cy3 intenzit na základě jejich pozice na sklíčku Krabicové grafy jednotlivých oblastí (nejčastěji print-tip) Diagnostika nerovnoměrné hybridizace Graf intensit kanálů Cy5 MA graf M = log (R/G) A = 1/2 (log(R)+log(G)) Neukáže nelineární trendy Diagnostika efektu barviva Ukáže nelineární trendy! §Často je efekt barviva větší u sond s nízkou expresí Cy3 = B0 + B1*Cy5 (Cy3-B0)/B1=Cy5’ Cvičení! •Budeme pracovat v programu R-Studio •Ukážeme si jak instalovat balíky pro specifické analýzy genomických a proteomických dat •Na příkladových datech uděláme diagnostiku kvality mikročipu Bioconductor •Bioconductor je projekt v R speciálně určený pro analýzu molekulárních dat •Obsahuje nejenom speciální balíky, ale i typy objektů, smyslem je standardizace a minimalizace chyb! Bioconductor - instalace • • •Jak instalovat: https://www.bioconductor.org/install/ • •Do R příkazového řádku zadáme: if (!require("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install(version = "3.18") •Instalace základních balíků: if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install() Bioconductor – instalace balíků Pro instalaci specifického balíku použijeme kód: BiocManager::install(c("nazevbaliku1", "nazevbaliku2")) POZOR NA uvozovky, musí být ", ne “ Balík marray •Balík marray poskytuje sadu funkcí pro analýzu cDNA čipů BiocManager::install("marray") •Základní struktura, se kterou pracuje, a která obsahuje základní data všech matic experimentu je třída marrayRaw new('marrayRaw', maRf = ...., # matice intensit spotů červeného kanálu maGf = ...., # matice intensit spotů zeleného kanálu maRb = ...., # matice intensit pozadí červeného kanálu maGb = ...., # matice intensit pozadí zeleného kanálu maLayout = ...., # objekt třídy marrayLayout, popis mikročipu maGnames = ...., # objekt třídy marrayInfo, popis sond maTargets = ...., # objekt třídy marrayInfo, popis vzorků maNotes = ...., # text - poznámky ) Další objekty balíku marray •marrayLayout - popisuje mikročip, umístění spotů a jejich sondy new('marrayLayout', maNgr = ... , #počet řádků matic maNgc = ..., #počet sloupců matic maNsr = ..., #počet řádků v matici maNsc = ..., #počet sloupců v matici maNspots = ..., # maNgr x maNgc x maNsr x maNsc maSub = ..., # vektor TRUE/FALSE, které spoty se používají maPlate = ..., # faktor – print tip maControls = ..., # faktor – status sondy (kontrolná nebo ne?) maNotes = ..., # Object of class character) maNsr maNsc maNgr maNgc Další objekty balíku marray •marrayInfo - popisuje vzorky nebo sondy new('marrayInfo', maLabels = ...., # vektor jmen/názvů maInfo = ...., # datová tabulka s dalšími charakteristikami maNotes = ...., # text s poznámkami ) Cvičení V Rstudiu si otevřeme soubor cDNA-kontrolaKvality-priklad1.R Postupujeme podle instrukcí cDNA mikročipy – normalizace Normalizace uvnitř mikročipu I. •Cíl: Upravit hodnoty signálu tak, abychom odstranili systematické odchylky uvnitř mikročipu •Princip: Centrování a/nebo škálování hodnot exprese M kde l a s jsou normalizační hodnoty střední hodnoty (l) a škály (s) Normalizace uvnitř mikročipu I - metody §Typy normalizace: 1) Logaritmická transformace – většinou používaná z důvodu transformace dat na normální rozdělení Normalizace uvnitř mikročipu I - metody §Typy normalizace: 1) Logaritmická transformace – většinou používaná z důvodu transformace dat na normální rozdělení 2) Korekce na pozadí - odstraňuje efekt pozadí - odlišné přístupy: 1) odpočítá se odhadnutý signál pozadí – založené na předpokladu aditivity signálu Pozorovaný signál (OS) = Signál pozadí (BS) + Signál sondy (TS) TS = OS - BS - buď pro každý spot zvlášť, nebo globálně střední hodnota odhadnutého signálu pozadí 2) bez korekce! Normalizace uvnitř mikročipu I - metody 3) Normalizace prostorového efektu a rozdílů intenzit mezi kanály •Centrování mediánem •odečítá medián signálu od intenzit signálu všech spotů •nejjednodušší, ale není schopný zkorigovat nelinearitu l je medián intenzit signálu všech spotů Problémy s mediánovým centrováním Log2(Cy3) Graf intensit kanálů A MA graf Jedná se o globální metodu, není schopna vyrovnat lokální efekty, problémy odlišných intenzit, print-tip efekty atd. S nelinearitou si umí poradit lokálně regresní metody (lo(w)ess) Lowess normalizace I Lokální odhad Před lowess normalizací Po lowess normalizaci Princip: 1. Odhad křivky pomocí neparametrické lokálního (váženého) vyhlazování (lo(w)ess - locally (weighted) scatterplot smoothing) 2. Odečtení odhadnuté křivky od naměřených hodnot Výhoda : není nutné znát funkci křivky, je odhadnuta z dat! Lowess normalizace II Princip lowess •V každém kroku se určí lokální množina dat, na které se odhadne křivka s pomocí polynomiálu a metody nejmenších čtverců • Parametr l určuje stupeň polynomiálu (l=0 půměr, l= 1 lineární regrese, l=2 kvadratická regrese) • Množina dat na které se pracuje se určuje pomocí algoritmu nejbližšího souseda • Vyhlazovací parametr a určuje velikost této množiny (na bodů v okolí odhadovaného bodu) • nabývá hodnot mezi (l + 1)/n a 1 •Křivky odhadujeme: •na základě signálů všech sond na mikročipu •Předpoklad: exprese většiny genů, které sondy představují, není změněná mezi porovnávanými skupinami! (závisí od mikročipu a od testované hypotézy) • •na základě signálu skupiny sond: i) skupina sond by měla mít přibližně stejnou expresi ve všech vzorcích (abychom neodstranili reálné biologické rozdíly) ii) množina by měla být dostatečně velká, aby zachytila variabilitu sklíčka Např. housekeeping geny Normalizace uvnitř mikročipu II. Úrovně úpravy datových souborů Úroveň sondy: Kvalita jednoho spotu na mikročipu Úroveň mikročipu: Kvalita celého mikročipu Úroveň experimentu: Kvalita měření transkriptu všech mikročipů v experimentu Mikročipy 1 ... n Kvalita mikročipu Kvalita experimentu Kvalita sondy Úroveň mikročipu (základní datová matice) Úroveň experimentu (finální datová matice) Odstranění nekvalitních spotů Sumarizace duplikátů Normalizace uvnitř mikročipu Normalizace mezi mikročipy Normalizace mezi mikročipy §Když jsou všechny datové matice mikročipů znormalizované, tak vytváříme finální datovou matici, kterou použijeme pro následnou analýzu řádky ~ vzorky, sloupce ~ geny §Jednotlivé soubory musíme normalizovat navzájem, abychom odstranili efekty mezi sklíčky, způsobené rozdílnou hybridizací, rozdílným množstvím vzorku (mRNA), rozdílným efektem skenování, chybami v segmentaci... apod. §Princip – sjednocení rozložení (průměr, směrodatná odchylka, případně kvantily) Metody normalizace mezi mikročipy •Globální centrování •Nastaví průměr a škálu všech sklíček na jednu hodnotu (medián, průměr, ořezaný průměr... všech čipů nebo hodnoty referenčního čipu) •Nevýhoda: předpokládá, že rozdíly jsou jen posunové, lineární •Škálování •Tato metoda sjednocuje variabilitu jednotlivých mikročipů, například podělením hodnot mediánovou absolutní odchylkou jejich intenzit. Obvykle se kombinuje s centrováním. •Loess •Probíhá cyklickým způsobem – vždy mezi páry mikročipů až do konvergence. Také je možné vybrat množinu sond na kterých se udělá odhad loess křivky •Kvantilová normalizace Kvantilová normalizace Je založena na pořadí pozorování, je tedy neparametrická. Buď na skupině všech sond, nebo jen na skupině vybraných sond. Princip: U každého mikročipu se geny seřadí dle hodnoty exprese a tyto hodnoty se potom nahradí průměrnou hodnotou kvantilu, který představuje v celém čipu Gen čip1 čip2 čip3 A iv iii i B i i ii C ii iii iii D iii ii iv pořadí čip1 čip2 čip3 i 2 1 3 ii 3 2 4 iii 4 4 6 iv 5 4 8 Seřazené hodnoty Gen čip1 čip2 čip3 A 5 4 3 B 2 1 4 C 3 4 6 D 4 2 8 hodnoty průměr (2+1+3)/3 = 2.00 = pořadí i (3+2+4)/3 = 3.00 = pořadí ii (4+4+6)/3 = 4.67 = pořadí iii (5+4+8)/3 = 5.67 = pořadí iv Kvantilová normalizace Gen čip1 čip2 čip3 A iv iii i B i i ii C ii iii iii D iii ii iv pořadí čip1 čip2 čip3 i 2 1 3 ii 3 2 4 iii 4 4 6 iv 5 4 8 Seřazené hodnoty Gen čip1 čip2 čip3 A 5 4 3 B 2 1 4 C 3 4 6 D 4 2 8 hodnoty Je založena na pořadí pozorování, je tedy neparametrická. Buď na skupině všech sond, nebo jen na skupině vybraných sond. Princip: U každého mikročipu se geny seřadí dle hodnoty exprese a tyto hodnoty se potom nahradí průměrnou hodnotou kvantilu, který představuje v celém čipu průměr (2+1+3)/3 = 2.00 = pořadí i (3+2+4)/3 = 3.00 = pořadí ii (4+4+6)/3 = 4.67 = pořadí iii (5+4+8)/3 = 5.67 = pořadí iv Kvantilová normalizace Gen čip1 čip2 čip3 A iv iii i B i i ii C ii iii iii D iii ii iv pořadí čip1 čip2 čip3 i 2 1 3 ii 3 2 4 iii 4 4 6 iv 5 4 8 Seřazené hodnoty Gen čip1 čip2 čip3 A 5 4 3 B 2 1 4 C 3 4 6 D 4 2 8 hodnoty Gen čip1 čip2 čip3 A 5.67 4.67 2.00 B 2.00 2.00 3.00 C 3.00 4.67 4.67 D 4.67 3.00 5.67 normalizované hodnoty Je založena na pořadí pozorování, je tedy neparametrická. Buď na skupině všech sond, nebo jen na skupině vybraných sond. Princip: U každého mikročipu se geny seřadí dle hodnoty exprese a tyto hodnoty se potom nahradí průměrnou hodnotou kvantilu, který představuje v celém čipu Shrnutí •Základní data nejsou mRNA koncentrace • •Musíme zkontrolovat kvalitu dat na různých úrovních •Úroveň sondy •Úroveň sklíčka (všechny sondy na sklíčku) •Úroveň genu (gen mezi sklíčky) • •Data vždy transformujeme logaritmem, abychom zabezpečili normální rozložení hodnot • •Data normalizujeme abychom odstranili systematické (technické) chyby Procvičování na doma •Podívame se do našeho adresáře s cDNA příkladem a otevřeme cDNA.R v programu Rstudio. • •Postupujeme dle instrukcí, na konci je dobrovolný úkol. •