Základy virologické diagnostiky BSL-1 1. Stupeň biologické ochrany – Biosafety level 1 (BSL1) – je určen pro práci s málo infekčními a nebezpečnými původci infekčních onemocnění, mezi které patří převážně baktérie například Salmonella a mnohé ostatní enterobakterie, Stafylokoky a Streptokoky, Pneumokoky pouze ochranné oděvy (běžné bílé pláště) a ochranné rukavice Podobnými laboratořemi disponuje každá nemocnice. BSL-2 Pracovníci na této úrovni používají vždy ochranné oděvy a rukavice, doplněné o prostředky pokročilé ochrany – o respirační filtry, obličejové štíty a jiné. Laboratoře na BSL2 vyžadují pro manipulaci s infekčními původci specielní přístrojové vybavení například boxy s laminárním prouděním vzduchu BSL-3 Biosafety level 3 (BSL3) – je určen pro rutinní manipulaci s nebezpečnými původci nákaz. Protože proti těmto původcům mnohdy neexistuje účinná léčba je vyžadováno mnohonásobné očkování. Mezi původce zařazené na BSL 3 patří virus HIV, virus klíšťové encefalitidy či bakteriální původci tyfu a anthraxu. Ochranné prostředky na úrovni BSL3 jsou rozšířeny na kompletní ochranné kombinézy s kapucí doplněné pasivní respirační přístroj pracující na podobném principu jako plynové masky (vzduch prochází speciálním tzv. HEPA filtrem, který zachytí infekční původce a propustí jen vzduch). BSL-4 Biosafety level 4 (BSL4) – je určen pro specielní manipulaci s vysoce infekčními původci onemocnění proti nimž neexistuje účinná léčba ani očkování. Sem řadíme například virus Eboly, virus Lassa, virus SARS, hantaviry, ruské kmeny viru klíšťové encefalitidy a mnohé ostatní převážně virové původce Ochranné prostředky na těchto úrovních spočívají v použití speciálních skafandrů (kompletních hermeticky uzavřených obleků) s vlastním oběhem kyslíku pocházejícího buď z centrálního rozvodu, nebo aktivního respiračního přístroje. Trojnásobná vrstva rukavic. Kdy je laboratorní virologická diagnostika nutná nebo přínosná? 1. U onemocnění, u kterých jsou dostupná vhodná chemoterapeutika (nejen cílená antivirotika, ale třeba i interferon, hyperimunní séra apod.) 2. Správná diagnostika některých chorob vede k úpravě režimu pacienta a prognóze 3. Protiepidemická opatření 4. Sledování virových onemocnění – výskyt, šíření, epidemiologie Onemocnění Odebrané vzorky Respirační infekce Výtěry z krku nebo nosu Postnasální výplachy Gastrointestinální infekce Stolice Měchýřkovitá vyrážka Vesikulární tekutina, výtěr z krku, stolice Hepatitida Sérum, stolice CNS infekce Mozkomíšní mok, výtěr z krku, stolice AIDS Nesrážlivá krev Metody diagnostiky virových infekcí a. Přímá detekce (obvykle kultivace v buněčných kulturách – izolace viru; elektronová mikroskopie, imunofluorescence, PCR) b. Nepřímá – serologické metody – identifikace a kvantifikace specifických protilátek v séru pacienta Oba způsoby přinášejí značné nevýhody – v prvním případě pracnost, nákladnost a časová náročnost (kromě PCR), ve druhém malá vypovídací hodnota a spolehlivost • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Kultivační metody Buněčné kultury -1949 – poprvé pozorováno, že poliovirus se množí v kultuře buněk za produkce charakteristických histologických změn -Práce za aseptických podmínek (přesto časté problémy s kontaminacemi bakteriemi, mykoplasmaty, kvasinkami či houbami) -Buněčné kultury posloužily k objevu řady nových virů a virových čeledí (např. adenovirů, echovirů, rhinovirů apod.) -Cenná pomůcka při diagnostice virových onemocnění či pro vývoj vakcín (dětská obrna, spalničky, zarděnky) Virová infekce v buněčné kultuře • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Produkce velkého množství viru pro přípravu vakcín - chřipka • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Laboratorní zvířata -Laboratorní myši, potkani, morčata, primáti -Nutno pracovat na základě zvláštního povolení, pouze pracovníci se zvláštní kvalifikací -Zvláštními právními předpisy a vyhláškami stanoveno, jaké mají mít osvětlení, hladina hluku, denní režim, potrava (i zastoupení jednotlivých výživových látek), velikost chovných nádob, způsob nakládání... • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Elektronová mikroskopie Hlavní nevýhoda spočívá v nízké citlivosti detekce, nákladnosti. Nutná značná zkušenost s rozlišením virových částic od jiných částí buněk či artefaktů. Elektronová mikroskopie Imunoelektronová mikroskopie Na protilátky navázány částečky koloidního zlata; možno současná detekce více patogenů – použijí se kuličky různé velikosti. Imunoelektronová mikroskopie vykazuje mnohem vyšší citlivost v porovnání s klasickou elektronovou mikroskopií; v diagnostice se však obvykle nepoužívá. • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Imunofluorescence Průkaz přítomnosti viru v klinickém materiálu nebo v buněčné kultuře inokulované pacientským vzorkem. Imunofluorescence • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Hemaglutinační testy • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý ELISA na průkaz antigenu • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Latexová aglutinace Protilátky jsou vázány na latexové částice. Po smíchání s virem dojde k pouhým okem viditelné agutinaci latexových částic. Užití: zejména u průjmových onemocnění (rotaviry, adenoviry) • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Průkaz virové nukleové kyseliny Průkaz protilátek Sérologické vyšetření protilátek proti adenovirům (AV), cytomegaloviru (CMV), viru Epsteina a Barrové (EBV), enterovirům, hantavirům, virům hepatitidy, herpetickým virům, viru lidského imunodeficitu (HIV), virům chřipky, viru klíšťové encefalitidy, viru lymfocytární meningitidy, papillomavirům, parvoviru B19, virům parainfluenzy (PIV), polyomavirům, viru příušnic, Respiračnímu syncytiálnímu viru (RSV), viru spalniček, viru varicella zoster (VZV), viru zarděnek, chlamydiím Pro sérologické vyšetření se odebírá žilní krev bez použití protisrážlivých prostředků s dodržováním všech bezpečnostních pravidel (dezinfekce místa vpichu, stříkačky a jehly pro jedno použití, rukavice pro jedno použití pro odebírající personál). Odběr by se měl provádět nejlépe ráno nalačno za aseptických podmínek. - Vyšetření párových sér Sérologické vyšetření protilátek • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý ELISA • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Metoda vazby komeplementu • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Neutralizační test • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Imunoblotting • kultivace na TK • kuřecí embrya • pokus na zvířeti • elektronová mikroskopie • světelná mikroskopie, imunofluorescence • hemaglutinace • hemadsorpce • ELISA • latexová aglutinace • průkaz virové NK Přímý • ELISA • komplement-fixační test • virus-neutralizační test • inhibice hemaglutinace • imunoblotting Nepřímý Multiplicita infekce – multiplicity of infection (MOI) kde: m = multiplicita infekce (MOI) n = počet virů infikujících buňku P(n) = pravděpodobnost, že buňka bude infikována počtem n virionů Plaková titrace. Virová suspenze ředěná určitým faktorem se přidá k jednovrstvě buněk. Buňky se barví v okamžiku, kdy virus infikuje jednu buňku, tu zlyzuje a nakazí okolní buňky za vzniku plaku. Každý plak je tedy výsledkem původně infekce jedné buňky jedním virem. Plaková titrace – plaque assay Velikost a morfologie plaků Reed & Münch endpoint calculation method