1
Petra Vašíčková
pvasickova@sci.muni.cz
Metody detekce virů v potravinách
a prostředí
(Cristina and Costa-Mattioli, 2007)
Metody detekce
• Průkaz protilátek (IgM, IgG) – komerčně dostupné soupravy
• Přímý průkaz viru (RT-PCR, RT-qPCR)
➢ Stolice, sérum
➢ Kladen důraz na včasný odběr vzorku, řádné skladování/transport
➢ RT-qPCR možno použít ke stanovení virové nálože ve vzorku
➢ RT-PCR - analýza sekvencí
(nástroj molekulární epidemiologie)
Metody detekce – přímý průkaz viru
• Infekce prasat či jiných experimentálních zvířat (opice, prase
domácí, myš, tarbík, králík, potkan, kosman)
• Klinické příznaky – opice, vysoká infekční dávka
• Bez klinických příznaků – vylučování viru trusem, viremie a/nebo
serokonverze
(Dalton et al., 2008)
Metody detekce – přímý průkaz viru
• Buněčné kultury – buněčné linie lidského karcinomu jater
(PLC/PRF/5, HepG2/C3A), karcinomu plic (A549)
• Ve většině případů bez cytopatického efektu - RT-qPCR,
immunofluorescence
• 2D × 3D formát
• Není standardizováno
•Problémové kultivace virů na tkáňových kulturách → metody založeny
na přímém průkazu genomu viru
•V potravinách či prostředí malé množství virových částic → potřeba
dostatečně citlivé metody
•RT-qPCR
•ISO/TS 15216
Metody průkazu virů v potravinách a
prostředí
•„Komplikovaný“ proces analýzy vzorku → zavedení externí kontroly
celé analýzy
➢ Bakteriofág MS2 - do genomu vložena unikátní sekvence (vakovlk
tasmánský a pták moa)
➢ Kontrola celého postupu analýzy každého vzorku (přidáno
definované množství)
➢ Stanovení účinnosti izolace NK – kvantifikace virové nálože v
definovaném množství vzorku
Metody průkazu virů v potravinách a
prostředí
Foto H. Malenovská
Homogenizace Centrifugace
8 000 x g
20 min
4°C
Bakterie, parazité
Detekce DNA (qPCR)
Kultivace
Viry
Detekce RNA (RT-qPCR)
Peleta Supernantant
(Stomacher/vytřepávání
v TGBE)
Postup zpracování vzorků v laboratoři
Vyšetření vzorků
Izolace RNA TqRT-PCR
-+Nested RT-PCR
Sekvenování
Analýza sekvencí
Genotypizace
Epidemiologické × epizootologické studie
Voda Filtrace/primární
zakoncentrování
Eluce virových částic
Sekundární
zakoncentrování
Izolace nukleových kyselin
Detekce genomu viru Detekce infekčních
virových částic
?
Odběr vzorku
• Čistý kanystr/nádoba
• Objem vzorku 10 l, možnost i menší objemy (200 ml)
• Vzorek skladovat v temnu a chladu
• Transport do laboratoře (chlazené) nejlépe do 24 hod od odběru
(Cashdollar and Wymer, 2013)
Izolace virových částic z vody
• Adsorpce na negativně nabité filtry
(Millipore)
➢ 10 l
➢ Limit detekce 100 000 virových částic
(10 000/l)
• Přímá flokulace
➢ 200 ml
➢ Limit detekce 10 000 virových částic
(50 000/l)
Průkaz viru ve vzorku
• Molekulární metody - qPCR, RT-qPCR
➢ Kvantifikace – DNA/RNA koncentrační gradient
➢ Problém s falešně negativními výsledky – inhibiční faktory
(interní amplifikační kontrola, analýza ředěné NK)
• RT-PCR (molekulární epidemiologie/epizootologie)
• Problém rozlišit infekční × neinfekční virové částice