1
Petra Vašíčková
pvasickova@sci.muni.cz
Odpadní vody
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
SARS-CoV-2
• Vylučování stolicí až u 50 % infikovaných
➢ neprokázán přenos fekálně-orální cestou (infekčnost viru
ve stolici?)
➢ neprokázán přenos kontaminovanou vodou – předpoklad
inaktivace viru během procesů čištění odpadních vod
• Průkaz RNA SARS-CoV-2 v moči (30 %)
➢ https://heis.vuv.cz/data/webmap/datovesady/projekty/
covmon/ docvystupy/Vsouhrn_COVMON-
VI04000017_2022_final.pdf
(https://en.wikipedia.org/wiki/History_of_coronavirus)
2
3
• Primární zaměření projektu
➢ posoudit současnou epidemiologickou situaci – SARS-CoV-2
➢ stanovit míru výskytu SARS-CoV-2 v odpadních vodách v ČR
➢ posoudit míru rizika přenosu SARS-CoV-2 ve spojení s odpadní vodou
• Analyzované vzorky
➢ 7 ČOV, 2 × 28 vzorků (interval 3 týdny)
➢ voda na přítoku, během čistírenského procesu a na odtoku z ČOV
➢ anonymní vzorky
➢ adaptace akreditované metody (Mlejnkova et al., 2020)
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
Projekt SOVAK (14.4. – 6.5.2020)
Výsledky projektu SOVAK – RNA SARS-CoV-2
- negativní, + pozitivní výsledek; Vašíčková a kol., 2020
4
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/
VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU
ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE
VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM
EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022,
MV0/VI)
5
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/
VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU
ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE
VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM
EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022,
MV0/VI)
6
Vašíčková, Hrdý, Krásna, Sovová,
Gharwalová, Mlejnková. Metodický postup
analýzy odpadních vod na přítomnost
specifických oblastí genomu SARS-CoV-2.
Metodický postup 141, 2022.
https://www.vri.cz/vyzkum/databaze-aplikovanych-vysledku/
7
Metodický postup
• Výběr vhodné metody
• Řádný odběr vzorku
• Transport vzorku do laboratoře × stabilita vzorku
• Systém kontrol celého postupu
➢ kontrola odběru vzorku a podmínek transportu do
laboratoře (preanalytická fáze)
➢ kontrola zpracování vzorku v laboratoři (analytická fáze)
➢ kontrola detekčního a kvantifikačního kroku (analytická
fáze)
• Charakteristika metodického postupu a mezilaboratorní
porovnání
• Řádná interpretace výsledků
➢ Statistická analýza dat
➢ Faktory ovlivňující výsledky
https://www.cdc.gov/nwss/testing.htm
l
7
8
Metodický postup
• Výběr vhodné metody
➢ vzorky odpadních vod uměle kontaminovány definovaným množstvím vybraných
virových agens (5 × 106 GE), výpočet účinnosti
➢ důraz – uživatelsky jednoduchá metoda, dostupné vybavení/reagencie, cena, rychlost
8
Agens
Organická
flokulace, BE
Precipitace,
PEG/NaCl
Anorganická
flokulace, Al
Centrifugace
10 000×g/30 min
Virus přenosné gastroenteritidy prasat
(TGEV)
42,64 % 43,94 % 17,55 % 17,55 %
Defektní bakteriofág MS2 (aRNA) 5,81 % 26,94 % 0,83 % 5,41 %
Bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1) 11,40 % 41,11 % 0,56 % 15,85 %
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
SARS-CoV-2
• Vylučování stolicí až u 50 % infikovaných
➢ neprokázán přenos fekálně-orální cestou (infekčnost
viru ve stolici?)
➢ neprokázán přenos kontaminovanou vodou –
předpoklad inaktivace viru během procesů čištění
odpadních vod
• Průkaz RNA SARS-CoV-2 v moči (30 %)
➢ https://heis.vuv.cz/data/webmap/datovesady/projekty/
covmon/ docvystupy/Vsouhrn_COVMON-VI04000017_2022_final.pdf
(https://en.wikipedia.org/wiki/History_of_coronavirus)
9
10
• Primární zaměření projektu
➢ posoudit současnou epidemiologickou situaci – SARS-CoV-2
➢ stanovit míru výskytu SARS-CoV-2 v odpadních vodách v ČR
➢ posoudit míru rizika přenosu SARS-CoV-2 ve spojení s odpadní vodou
• Analyzované vzorky
➢ 7 ČOV, 2 × 28 vzorků (interval 3 týdny)
➢ voda na přítoku, během čistírenského procesu a na odtoku z ČOV
➢ anonymní vzorky
➢ adaptace akreditované metody (Mlejnkova et al., 2020)
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
Projekt SOVAK (14.4. – 6.5.2020)
Výsledky projektu SOVAK – RNA SARS-CoV-2
- negativní, + pozitivní výsledek; Vašíčková a kol., 2020
11
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/
VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU
ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE
VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM
EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022,
MV0/VI)
12
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
https://www.vuv.cz/virus-covid19-v-odpadnich-vodach/o-tematu-23/
VI04000017 - VYUŽITÍ MONITORINGU
ODPADNÍCH VOD JAKO NÁSTROJE
VČASNÉHO VAROVÁNÍ PŘED VZNIKEM
EPIDEMIOLOGICKÉ SITUACE (2021-2022,
MV0/VI)
13
Vašíčková, Hrdý, Krásna, Sovová,
Gharwalová, Mlejnková. Metodický postup
analýzy odpadních vod na přítomnost
specifických oblastí genomu SARS-CoV-2.
Metodický postup 141, 2022.
https://www.vri.cz/vyzkum/databaze-aplikovanych-vysledku/
14
Metodický postup
• Výběr vhodné metody
• Řádný odběr vzorku
• Transport vzorku do laboratoře × stabilita vzorku
• Systém kontrol celého postupu
➢ kontrola odběru vzorku a podmínek transportu do
laboratoře (preanalytická fáze)
➢ kontrola zpracování vzorku v laboratoři (analytická fáze)
➢ kontrola detekčního a kvantifikačního kroku (analytická
fáze)
• Charakteristika metodického postupu a mezilaboratorní
porovnání
• Řádná interpretace výsledků
➢ Statistická analýza dat
➢ Faktory ovlivňující výsledky
https://www.cdc.gov/nwss/testing.htm
l
14
15
Metodický postup
• Výběr vhodné metody
➢ vzorky odpadních vod uměle kontaminovány definovaným množstvím vybraných
virových agens (5 × 106 GE), výpočet účinnosti
➢ důraz – uživatelsky jednoduchá metoda, dostupné vybavení/reagencie, cena, rychlost
15
Agens
Organická
flokulace, BE
Precipitace,
PEG/NaCl
Anorganická
flokulace, Al
Centrifugace
10 000×g/30 min
Virus přenosné gastroenteritidy prasat
(TGEV)
42,64 % 43,94 % 17,55 % 17,55 %
Defektní bakteriofág MS2 (aRNA) 5,81 % 26,94 % 0,83 % 5,41 %
Bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1) 11,40 % 41,11 % 0,56 % 15,85 %
16
Metodický postup
• Systém kontrol celého postupu
➢ kontrola odběru a transportu vzorku do laboratoře
➢ humánní adenoviry (indikátory fekálního znečištění) - qPCR
➢ kontrola zpracování vzorku v laboratoři (účinnost
izolace)
➢ umělá kontaminace každého vzorku TGEV (5 × 106 GE) –
RT-qPCR
➢ kontrola detekčního a kvantifikačního kroku - RT-qPCR
➢ interní amplifikační kontrola
➢ pozitivní kontrola - RNA gradient (in vitro transkript)
➢ kvantifikace
https://www.cdc.gov/nwss/testing.htm
l
16
SARS-CoV-2 (GE/500 ml) = ((x / 5) × y) × 14,29 × (100 / účinnost
izolace TGEV)
17
Metodický postup
• Charakteristika metodického postupu
➢ Citlivost/limit detekce (LOD), opakovatelnost a účinnost
17
Ředění
Teoretické množství
kopiía
Získané množství kopií b Počet pozitivních vzorků /celkový
počet analyzovaných vzorků
Účinnost
(%)Průměr SDc
1 5 000 000 3 555 500 2 029,66 12/12 59,43
2 500 000 307 403 2 544,28 12/12 42,64
3 50 000 29 715 304,42 12/12 35,41
4 5 000 974 21,29 12/12 19,48
5 2 500 914 62,38 12/12 36,56
6 1 250 80 47,07 12/12 6,40
7 500 - - 4/12 a
Množství kopií viru, které bylo stanoveno použitím RT-qPCR.
b Skutečné množství kopií bylo získáno podle příslušné kalibrační křivky zařazené v každém experimentu, následně byl spočítán průměr a směrodatná odchylka.
c Směrodatná odchylka.
➢ LOD - 1 250 GE/500 ml, tzn. 2,5 GE/1 ml odpadní vody
➢ Specifita - Alphacoronavirus 1 (CAPM V-346, TGEV), Canine coronavirus (CAPM V-485), Avian coronavirus (CAPM V-440), Betacoronavirus 1 (Bovine coronavirus
CAPM V 326), Porcine hemaglutinating Encephalomyelitis virus (CAPM V-316), Human adenovirus 2 (CAPM V-665), Human respiratory syncytial virus (NCPV, Catalogue No.
0012031v), Human rhinovirus (NCPV, Catalogue No 930), Influenza A (NCPV, Catalogue No 878), Influenza B (NCPV, Catalogue No 797).
18
Metodický postup
• Mezilaboratorní porovnání
➢ pořadatel - Laboratoř hygieny půdy a odpadů, SZÚ
➢ účastníci - laboratoř Virologie potravin a prostředí a
Zkušební laboratoře Ústavu biochemie a mikrobiologie
(VŠCHT)
➢ vyhovující z-skóre: |z| ≤ 2
https://www.cdc.gov/nwss/testing.htm
l
18
19
Metodický postup
• Řádná interpretace výsledků
➢ statistická analýza
➢ epidemiologická data
➢ faktory ovlivňující výsledky – srážky,
chemické parametry, množství odpadních
vod (faktor ředění srážky), podíl
průmyslových odpadních vod, délka
kanalizační sítě, počet obyvatel napojených
na ČOV, varianta viru, roční období,
četnost vzorkování, počet „napojených“
obyvatel atd.
19
20
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
20
Predikce vzniku a vývoje epidemie Nástroj molekulární epidemiologie
➢ RNA SARS-CoV-2 v odpadních vodách
je možné detekovat dříve, než je
prokázána klinickými testy
➢ k dosažení pozitivní detekce RNA SARSCoV-2
v odpadních vodách – min. 4-17
(medián 8), 9-43 (medián 18) a 17-97
(medián 38) denně hlášených nových
případů covid-19/100 000 obv. pro
hladiny pravděpodobnosti 50 %, 80 % a
99 %
➢ stanovení/sledování variant agens v
populaci
Genom Čeleď Zástupci Klinické příznaky
ds DNA Adenoviridae adenovirus sérotyp 40/41 zvracení, průjem (zejména děti)
Polyomaviridae JC polyomavirus neurologické příznaky
ds RNA Reoviridae rotavirus (genoskupina A) zvracení, průjem (zejména děti)
+ss RNA Astroviridae lidský astrovirus sérotyp 1 zvracení, průjem (zejména děti)
Caliciviridae norovirus GI a GII zvracení, průjem
Hepeviridae virus hepatitidy E hepatitida
Picornaviridae virus hepatitidy A, poliovirus,
enterovirus A 71, aichivirus
hepatitida, neurologické příznaky, obrna, myokarditidy,
průjem
21
Epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE)
21
Agens Lokalita 1
(vstup/výstup)
Lokalita 2 (vstup/výstup) Lokalita 3
(vstup/výstup)
Lokalita 4
(vstup/výstup)
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
AdV -/- +/- -/- -/- +/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
NoV GI -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ +/NoV
GII -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- +/- -/+ -/+ +/+ -/- -/- -/- -/HAV
-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/HEV
-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/ČOV
(odběr vzorků – vstup/výstup, 4×, 2019)
Spolupráce DEKONTA
a.s.22
Výsledky projektu SOVAK
23
- negativní
+ pozitivní výsledek
NoV - noroviry
HAV - virus hepatitidy A
HEV- virus hepatitidy E
AdV - adenovivy,
indikátory fekálního
znečištění
Výsledky projektu BV
24
Projekt MZe QK1810212
Povrchová voda ČR (odběr jaro/podzim, 2018-2019)
Lokalita AdV NoV GI NoV GII HAV HEV
2018 2019 2018 2019 2018 2019 2018 2019 2018 2019
I +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/II
+/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/III
+/+ +/+ -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/IV
+/- +/+ -/- -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/V
+/+ -/+ -/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/VI
+/+ -/+ -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/VII
+/+ +/- -/+ -/- -/- +/- -/- -/- -/- -/VIII
-/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/IX
+/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/X
+/+ +/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/XI
+/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/XII
-/- -/- -/- -/+ -/- -/+ -/- -/- -/- -/XIII
-/+ +/+ -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/XIV
-/- -/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/XV
+/+ +/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/Projekt
MZe QK1810212, ZÚČM
2626
2727
Matrice Teplota Doba „přežití“ Virus
Hlávkový salát, jahody, šunka 4 , 10 a 21°C  7 dní NoV
Voda, mléko 63 a 72 °C 10 min NoV, HAV
Borůvky, maliny, jahody, bazalka,
petržel
- 20°C 90 dní NoV, HAV
Zelí, hlávkový salát 4, 25 a 37°C 21 dní NoV, HAV
Podzemní voda 10°C 2 roky NoV
Povrchová voda 4/22 °C > 42 dní/42 dní NoV
Odolnost virů souvisejících s alimentárním onemocněním
• Odolnost vůči vlivům vnějšího prostředí (chlad, acidorezistence, běžné desinfekční
postupy) → persistence dny, měsíce, roky
28
Odolnost virů souvisejících s alimentárním onemocněním
• Odolnost vůči vlivům vnějšího prostředí (chlad, acidorezistence, běžné desinfekční
postupy) → persistence dny, měsíce, roky
29
Povrchová voda ČR (zelenina)
Farmy NoV HAV
Zelenina 1/318 0/318
Voda 1/12 0/12
Prostředí (stěry) 0/58 0/58
Bylinky 4/115 0/115
Voda 5/14 0/14
Prostředí (stěry) 2/80 (ruce sběračů) 0/80
Projekt MZe QJ1210113
spolupráce ZÚČM
3030
Povrchová voda ČR (drobné ovoce)
Farmy NoV HAV
Jahody 2/156 0/156
Voda 3/23 0/23
Prostředí (stěry) 3/218 (ruce sběračů, toalety) 0/218
Tržní síť
Jahody CZ 0/45 0/45
Jahody dovoz 1/24 0/24
Ovoce mrazené 0/72 0/72
Ostatní (maliny, borůvky, ostružiny) 1/83 0/83
Projekt MZe QJ1210113,31
Molekulární epidemiologie
32
• Snaha o dosledování vehikula/zdroje kontaminace
• Potvrzení/vyvrácení epidemiologických souvislostí
• Porovnání sekvencí genomu virových agens prokázaných u lidí × prostředí × potravin
Noroviry - pitná voda, epidemiologické souvislosti
33
2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019
NoV GI 5 / 10 2 / 14 6 / 32 6/40 3/26 2/23 2/44
NoV GII 5/10 1/ 14 9 / 32 5/40 0/26 1/23 1/44
Spolupráce KHS, podpora grantu MZ 17-31921A
33
34
NoV II
Noroviry - pitná voda, epidemiologické souvislosti
34
NoV I
Virus hepatitidy A – epidemiologické souvislosti
35
• Epidemie VHA (Moravskoslezský kraj)
➢ voda výstup z domácí ČOV – HAV +
➢ pitná voda (blízká studna) – HAV +
➢ sekvenčně shoda s kmenem prokázaným u uživatelů studny
➢ přenos pitnou vodou podpořen epidemiologickými daty
Spolupráce KHS, podpora grantu MZ 17-31921A
• Epidemie VHA (Liberecký kraj)
➢ voda vstup, výstup z komunální ČOV – HAV +
➢ čistírenské kaly– HAV +
➢ sekvenčně shoda s kmenem prokázaným u tamních VHA pacientů
35