Název laboratoře:              Laboratoře Půdní environmentální chemie a toxikologie – SoilECT

Název instituce:                 Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Přírodovědecká fakulta
Masarykova univerzita

Adresa:                                 Kamenice 126/3, Brno, 625 00

Vedoucí:                              Prof. RNDr. Jakub Hofman, PhD.






                                   STANDARDNÍ OPERAČNÍ PROCEDURA


                                          SOILETOX-SOP-15



                  STANOVENÍ AMONIFIKACE  ARGININU (POTENCIÁLNÍ AMONIFIKACE, PAMO)


                                                                                      ( verze 2.0 )


ZPRACOVATEL METODY

Dne 10.9.2012 v Brně

RNDr. Jitka Černohlávková, Ph.D., Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D.


Verze upravená pro cvičení:

Účinky stresorů v ekosystémech_ terestrická část

Klára Šmídová 19.5.2022





















POUŽITELNOST METODY


Pro všechny typy a druhy půd. Půda by měla být odebrána a manipulována ve shodě s ISO 10381-6
(1993). Analýza by měla být provedena co nejdříve po odběru půdy. Před měřením by měla půda být
skladována ve 4°C maximálně 3 měsíce.



PRINCIP A STRUČNÝ POPIS METODY


Aminokyseliny uvolněné z proteinů extracelulárními enzymy během proteolýzy jsou uvnitř
mikrobiálních buněk dále metabolizovány (deaminace) a vznikají amonné ionty. Amonifikace
aminokyseliny argininu je běžný mikrobiální proces. Inkubace půdy s přídavkem L-argininu a následné
stanovení produkce amonných iontů v půdním extraktu se využívá pro stanovení potenciální
amonifikační aktivity.



ZDROJOVÉ NORMY A CITACE


Alef and Kleiner (1987):Arginoine ammonification: In Alef, K. and Nannipieri P.: Metods in Applied
Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press London, pp. 238-240



PŘÍSTROJE A POMŮCKY


třepačka, centrifuga, vortex, váhy, lžička, 15 ml polystyrénové zkumavky s víčky, pipeta 5 ml,
mikropipeta 0 - 1000 µl se špičkou, 96 jamkové mikrodestičky, spektrofotometr na mikrodestičky,
permanentní popisovač



POUŽITÉ CHEMIKÁLIE


L-arginin (50 mg/ 50 ml) - připravit

chlorid draselný 1 M (74,55 g KCl/l) - extrakční roztok

navážka:         500 ml             37,27 g KCl - připravit

            1000 ml           74,55 g KCl


destilovaná voda



Poznámky pro mě

Lufa:

WHC: 0,44 ml/g

Dry mass: 93,47%

Dovlhčit na 60% WHC – 0,2646 ml/g soil

ekv. 2gdw – 2,14 gww, ekv. 10 gdw – 10,70 g ww


PRACOVNÍ POSTUP – PAMO


Předinkubace:
týden před stanovením navážíme potřebné množství půdy do vhodné nádoby, ovlhčíme na 60% WHC a
inkubujeme v termostatu při 20 ± 2°C, v temnu.

Stanovení:

1.   předinkubovanou půdy rozvážíme po 2g sušiny do polyetylenových zkumavek, měření provádíme ve
dvou sadách – kontrola(K) a arginin (arg), pro každou připravíme 2 opakování (® celkem tedy
navážíme 4 x po 2 g od každé půdy

2.   do sady arginin napipetujeme 1 ml roztoku argininu, protřepeme na vortexu, a dáme inkubovat do
termostatu na 30°C (37°C) po dobu 3 hod.
do kontrolní sady přidáme 1 ml destilované vody, protřepeme na vortexu,  a dáme do mrazáku na 3 hod
(! cca 0,5 hod před koncem vytáhneme a necháme rozmrznout !)

3.   po třech hodinách inkubace do obou sad (K i arg) přidáme 10 ml 1M roztoku KCl, důkladně
protřepeme  (popř. vortexem) a dáme na třepačku na 45 min, 150-200 rpm

4.   zkumavky dáme centrifugovat na 5 min při 2500 rpm (pozor na vyvážení centrifugy –
zkontrolujeme na vahách!)

5.   v supernatantu stanovíme množství amonných iontů podle SOP-11a



Vyhodnocení:


Potenciální amonifikace PAMO:


NH[4]^+-N (mg/g sušiny/hod) = [arginin (NH[4]^+-N mg/g[suš]) – kontrola (NH[4]^+-N (mg/g[suš])]
                                                                            3 (hod)


Odečet provádíme metodou randomizace (rozdíl každý od každého), ze získaných hodnot vypočítáme
průměr a SD.