Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Mikroskopické praktikum II jarní semestr 2025 Úloha: Využití AFM mikroskopie při mapování mechanických vlastností Jakub Hruška Email: Jakub.Hruska@ceitec.muni.cz Barbora Brázdilová Email: 520913@mail.muni.cz CEITEC MU, Masarykova Univerzita 1. Teoretický úvod Mechanické vlastnosti buněk a jejich okolí hrají klíčovou roli v mnoha biologických procesech, jako je dělení, diferenciace, růst a pohyb buněk. Měření těchto vlastností, zejména tuhosti biologických systémů, má široké uplatnění v biomedicíně. Změny mechanických vlastností buněk totiž často souvisejí s různými onemocněními, včetně kardiovaskulárních chorob, artritidy nebo nádorových onemocnění, kde hrají roli například při tvorbě tumorů a formování metastáz. Anatomická stavba vzorku se liší v závislosti na typu tkáně a specifické funkci. Všechny tyto skutečnosti významně zvyšují obtížnost charakterizace mechanických vlastností těchto materiálů. Mikroskopie atomárních sil (AFM) je na rozdíl od ostatních mikroskopii založena na přímém mechanickém kontaktu próby se vzorkem, což umožňuje získat skutečné trojrozměrné informace o povrchové topografii. Rozlišení mikroskopu AFM může dosahovat až subnanometrových hodnot v závislosti na geometrii sondy, a to díky piezoaktuátoru, jenž po aplikaci napětí zajištuje přesný pohyb v ose z (prodloužení/oddálení od vzorku). I přes nelinearitu a hysterezi piezoelektrických materiálů lze tyto efekty překonat softwarovou kompenzací (closed/open loop design). Charakterizace povrchů může probíhat v různých podmínkách – ve vodě, vzduchu či jiných prostředích, což umožňuje analýzu vzorků in situ i in vitro, což je žádoucí zejména pro měření biologických vzorků. Krom topografie lze AFM využít pro charakterizaci povrchu prostřednictvím dalších parametrů jako je adheze, elasticita atd. Principem AFM je interakce hrotu sondy se vzorkem, která způsobuje ohyb raménka nosníku (cantilever). Na tento nosník, často vyrobený z nitridu křemíku (Si₃N₄), dopadá laserový paprsek. Pro zvýšení odrazivosti bývá nosník pokryt tenkou vrstvou kovu, například Au nebo Ag. Odražený laserový paprsek je následně detekován čtyř segmentovou fotodiodou, která zaznamenává vychýlení (ohyb) nosníku způsobené interakcí hrotu se vzorkem (viz Obrázek 1). Tento detektor se vyznačuje vysokou citlivostí a rychlou odezvou, přičemž jeho přesnost ovlivňuje například poloha a velikost světelné stopy na detektoru. Citlivost tak lze zlepšit zvýšením poměru například zmenšením světelné stopy a jejím umístění blízko středu detektoru. Nicméně existují i jiné systémy detekce např bez nutnosti optického systému – tzv. self sensing. Hrot může mít řadu tvarů (pyramidový, kónický...), pro měření mechanických vlastností buněk/hydrogelů, kdy nepotřebujeme vysoké rozlišení topografie použijeme nosník s kuličkou, pro který je definována většina modelů popisující indentaci (Sneddon, Fung, Ogden,..). Kuličkový hrot rovněž snižuje riziko propíchnutí měkkého materiálu, které může nastat, při použití ostrých hrotů (tedy s nižším rádiem hrotu). Rozdíly lze pozorovat především v rozložení tlaku způsobeného vnější silou, jelikož ostré hroty mají menší kontaktní plochu než hroty tupé. Kulovité hroty vytvářejí nízký lokální tlak a díky svému tvaru zajišťují platnost lineárních elastických modelů. Nevýhodou těchto hrotů je však nižší prostorové rozlišení. Obrázek 1: Schéma mikroskopu atomárních sil. Obecně jsou mechanické vlastnosti měřeny prostřednictvím mikroindentace (v našem případě AFM), během které je indentor (hrot kantilevru) s definovanou geometrií tlačen do materiálu (buňka, gel). Se samotným vzorkem tedy interaguje hrot, přičemž nosník slouží jako měkká pružina pro odečet kontaktní síly, dle Rovnice 1. 𝐹 = 𝑘 × ℎ Rovnice 1: F – síla; k – konstanta tuhosti nosníku; h – deflekce (prohnutí) nosníku. Odezva indentace je závislá nejen na mechanických vlastnostech vzorku, ale také na zmiňované geometrii hrotu a konstantě tuhosti nosníku (k). Výsledkem indentace je deflekce nosníku (h) v závislosti na z-pozici (viz Obrázek 2A) tzv. deflekční. Původní křivku tak lze po získání kontaktního bodu (bod, kdy dochází k prvnímu kontaktu hrotu se vzorkem; Z0) převést na indentační křivku (viz Obrázek 2B) na základě Rovnice 1 v závislosti na indentační hloubce (D), jenž se dostaneme prostřednictvím výpočtu z Rovnice 2. Obrázek 2: (A) deflekční a (B) silová-indentační křivka. Pozn. rozdíl mezi indentační a retrakční křivkou v obrázku A poskytuje rovněž cennou informaci – tj. viskoelastickou hysterezi vzorku. 𝐷 = (𝑍 − 𝑍0) − ℎ Rovnice 2: Výpočet indentační hloubky (D). Z0 – kontaktní bod, h – deflekce kantilevru, Z – pozice skeneru v ose z. Z výsledné indentační lze vypočíst mechanické vlastnosti (jako směrnici síly v závislosti na deformaci – tj. indentační hloubce). Nicméně takováto data by byla závislá na geometrii vzorků, jenž se napříč různými vzorky, přístroji liší. Z toho důvodu se využívají normalizované hodnoty mechanického napětí (𝜎 = 𝐹 𝐴 ; síla/plocha) a deformace (𝜀 = 𝛥𝐿 𝐿0 , změna indentační hloubky/ hloubkou před deformací) jenž jsou nezávislé na geometrii a velikosti, dle Hookova zákona (viz Rovnice 3). Po proložení indentační křivky (síla-indentační hloubka) modely (Hertz, DMT, Sheddon, …), jenž jsou standardně využívány pro měkké materiály, lze vypočítat Youngův modul pružnosti (E). (𝜎 = 𝐸 × 𝜀) Rovnice 3: Hookův zákon. σ – normálové napětí; E – Youngův modul pružnosti; ε – relativní prodloužení 𝐹 = 4 3 𝐸 (1 − 𝑣2) √𝑅𝐷3 Rovnice 4: Hertzův model pro sférický hrot, kde v – Poisonovo rozdělení (0,5 pro buňky), E – Younguv modul pružnosti, D – indentační hloubka. R – rádius hrotu próby. Provozní Režimy AFM můžeme rozdělit do tří základních kategorií: Kontaktní režim – v tomto režimu dochází k neustálému kontaktu hrotu se vzorkem. Následkem vzniklých třecích sil dochází jak k poškození povrchu vzorku, tak k opotřebení hrotu. Vlivem vysokého tření může také docházet ke vzniku artefaktů na vzorku. Tato metoda je tudíž nejinvazivnější ze všech uvedených metod a je vhodná pro tužší materiály. Konstantní síla je udržována zpětnovazebným mechanismem. Souřadnice Z poskytuje u všech režimů informaci o topografii povrchu. „Tapping“ model – na rozdíl od předchozího režimu, v tomto případě nedochází k neustálému kontaktu hrotu se vzorkem. Kantilever osciluje blízko své rezonanční frekvence a hrot se povrchu dotýká pouze na okamžik při každé oscilaci. Interakce mezi hrotem a povrchem vede ke změnám v rezonanční frekvenci kantilevru, což zpřesnuje detekci. Konstantní amplituda je udržována zpětnovazebným mechanismem. V důsledku přerušovaného kontaktu se vzorkem dochází k minimalizaci tření a metoda je šetrnější, což snižuje riziko opotřebení hrotu i vzorku. Tento skenovací mód je vhodný pro měkké vzorky. Rozlišení je podobné kontaktnímu režimu. Nekontaktní režim – kantilever vibruje blízko rezonanční frekvence (cca 100 kHz), na rozdíl od kontaktního režimu je však zde absence kontaktu hrotu a vzorku. Tato metoda využívá interakce skenovacího zařízení a vzorku pomocí slabých přitažlivých Van der Waalsových sil. Při přiblížení hrotu k povrchu dochází ke změně rezonanční frekvence, díky čemuž získáváme informace o topografii povrchu. Tyto změny jsou kompenzovány zpětnovazebným mechanismem. Nevýhodu této metody je nízká rychlost snímání a malé rozlišení. 2. Cíl praktické úlohy Naměřit a vyhodnotit mechanické vlastnosti připravených agarózových gelů. 3. Praktická část 3.2. Příprava agarózových gelů 1. Vypočítejte potřebnou hmotnost agarózy pro přípravu XY ml agarózy o koncentraci 0,5%, 1,5% a 3% w/v. 2. Navažte agarózu na analytických vahách dle požadované koncentrace a rozmíchejte v destilované vodě. 3. Smíchejte agarózu s odpovídajícím objemem destilované vody nebo pufru v kádince. 4. Zahřejte směs v mikrovlnné troubě a průběžně míchejte, tak aby nedošlo k vyvření. Opakujte, dokud se agaróza zcela nerozpustí. Přibližná doba ohřevu: 0,5% ± 45 s, 1,5% ± 45 s, 3% w/v ± 50 s. 5. Opatrně nalijte rozpuštěnou agarózu do připravené Petriho misky. 6. Přesuňte gel do lednice a nechte jej ztuhnout. Pozn.: Při koncentraci 3% gel tuhne velmi rychle. Během čekání připravte mikroskop atomárních sil. 7. Změřte mechanické vlastnosti připravených gelů pomocí mikroskopu atomárních sil. 3.3. Příprava přístroje 8. Pomocí pinzety vyberte a nasaďte vhodný kantilever na skleněný držák a zapněte AFM kontrolér. 9. Umístěte držák s kantileverem na AFM skener. 10. Spusťte JPK software a zvolte měřicí mód (PQNM, Force mapping). 11. Pomocí seřizovacích páček (na AFM skeneru) nasměrujte laser na kantilever tak, aby suma na detektoru byla co největší a laserový spot byl co nejblíže předpokládané pozici hrotu. Následně vycentrujte pozici laseru na detektoru (druhý typ seřizovacích páček) 12. Proveďte bezkontaktní kalibraci kantileveru a nastavte parametry skenování setpoint (nN); scan range (µm); resolution (px); scan speed (µm/s) 13. Opatrně odklopte AFM skener a vložte vzorek. Spusťte automatické přibližování sondy k povrchu a poté zapněte měření. 14. Soubory uložte a vyhodnoťte mechanická data (Youngův modul) v softwaru JPK Data Processing (software bude studentům zaslán po cvičení přes FileSender). 4. Výsledky Dle videonávodu studenti zpracují naměřená data mechanická data a vypočítají Youngův modul pružnosti pro připravené gely do tabulky níže. Vyhodnocení Youngova modulu pružnosti dle (2:20-7:40): https://is.muni.cz/auth/el/sci/ekurzy/CEIT_NAN_1/um/NanoBio- vyhodnoceni_JPK_processing_AtomicJ.mp4?predmet=1420656 Nastavení přístroje: https://is.muni.cz/auth/el/sci/ekurzy/CEIT_NAN_1/um/NanoBio- Mereni_AFM.mp4?predmet=1420656 Vzorek Youngův modul pružnosti - E (MPa) Okomentoval(a): [RO1]: Příprava vzorků i samotné měření by mělo být popsáno tak aby studenti byli schopni zvládnot sami nebo s odbornou dopomocí. Nebudeš dělat výuku tak, že se jen budou dívat nebo ano? Okomentoval(a): [RO2R1]: Má to být stručný návot jak obsluhovat přístroj. Budou se k němu vracet i při sepisování protokolu (Odkaz na celý kurz, pouze pro zájemce: https://is.muni.cz/auth/el/sci/ekurzy/CEIT_NAN_1/index.qwarp) Literatura: Galluzzi, Massimiliano, Chandra S. Biswas, Yuhang Wu, Qiao Wang, Bing Du, a Florian J. Stadler. „Space-Resolved Quantitative Mechanical Measurements of Soft and Supersoft Materials by Atomic Force Microscopy". NPG Asia Materials 8, č. 11 (listopad 2016): e327–e327. https://doi.org/10.1038/am.2016.170. Kirmizis, Dimitrios, a Stergios Logothetidis. „Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics". International Journal of Nanomedicine 5 (2010): 137–45. Sg, Kulkarni, Pérez-Domínguez S, a Radmacher M. „Influence of Cantilever Tip Geometry and Contact Model on AFM Elasticity Measurement of Cells". PubMed. Viděno 1. duben 2025. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37025035/. Thomas, Gawain, Nancy A. Burnham, Terri Anne Camesano, a Qi Wen. „Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy". Journal of Visualized Experiments : JoVE, č. 76 (27. červen 2013): 50497. https://doi.org/10.3791/50497. Okomentoval(a): [JP3]: To je odkaz na celý kurz, více bych tu rozepsal, kterou část a jak přesně mají použít.