Přírodovědecká fakulta a CEITEC Masarykova univerzita, Brno http://www.physics.muni.cz Mikroskopické praktikum II jarní semestr 2025 Úloha: Ramanova mikroskopie polymerních materiálů Jakub Máčala Email: macala@mail.muni.cz Radka Obořilová Email: radka.oborilova@ceitec.muni.cz CEITEC MU, Masarykova Univerzita 1. Úvod 1.1. Ramanova spektroskopie Ramanova spektroskopie představuje nedestruktivní techniku chemické analýzy schopnou poskytovat detailní informace o chemické struktuře, fázích, polymorfismu, krystalinitě a molekulárních interakcích. Základem této metody je interakce světelných fotonů s chemickými vazbami ve vzorku. Jedná se o techniku rozptylu světla, kdy molekuly ve vzorku rozptylují vysoce intenzivní světelné záření laseru. Pokud je světlo molekulou rozptýleno, oscilující elektromagnetické pole fotonu indukuje polarizaci molekulárního elektronového oblaku, což způsobí excitaci molekuly do vyššího energetického stavu rovnajícího se energii přenesené z fotonu. Tento proces se dá považovat za vytvoření komplexu s velmi krátkou dobou života mezi fotonem a molekulou, což bývá obvykle označováno za virtuální stav molekuly. Virtuální stavy nejsou stabilní, a proto je téměř okamžitě foton zpětně re-emitován jako rozptýlené záření. Naprostá většina rozptýleného světla má stejnou vlnovou délku jako dopadající záření a neposkytuje tedy žádnou informaci – elestický Rayleiho rozptyl. Velmi malý podíl světla je však rozptýlený s jinou vlnovou délkou, která závisí na chemické struktuře analytu – neelastický Ramanův rozptyl. Typicky se jedná o přibližně 1 foton z 10 milionů. V případě, kdy molekula získá část energie fotonu a je excitována do vyšší vibrační hladiny), tak má rozptýlený foton následně nižší energii a tedy vyšší vlnovou délku a jedná se tedy o tzv. Stokesův Ramanův rozptyl. Naopak, pokud molekula ztratila část energie v důsledku relaxace na nižší vibrační hladinu, tak rozptýlený foton odpovídající energii přijmul a je tedy rozptýlen s energií vyšší a tím pádem nižší vlnovou délkou, jedná se tedy o anti-Stokesův Ramanův rozptyl. Z kvantově-mechanického hlediska jsou si tyto dvě možnosti rovny, nicméně jelikož se majoritní část molekul přirozeně vyskytuje na základní vibrační hladině (obsazení energetických hladin kopíruje Boltzmanovu distribuci), tak je Stokesův rozptyl pravděpodobnější, a tedy více intenzivní. Obrázek 1: Možnosti rozptylu světla na studované molekule Ramanovo spektrum obsahuje různé množství píků, které odpovídají intenzitě a vlnové délce rozptýleného Ramanova záření. Jelikož však vlnová délka rozptylu závisí na vlnové délce excitačního světla a liší se tedy pro různé excitační zdroje, je nepraktické ji používat pro porovnávání spekter získaných za využití různých laserů. Z toho důvodu je vhodnější využívat tzv. Ramanův posun, tedy posun píků vzhledem k excitačnímu záření. Jednotlivé píky odpovídají specifickým vibracím chemických vazeb v molekulách, jako jsou například vazby C-C, C=O, N-O, C-H, atp., či skupinám vazeb jako jsou například benzenová jádra, vibrace polymerních řetězců atd. Ne všechny vibrační módy jsou však detekovatelné pomocí Ramanovi spektroskopie, podmínkou je změna polarizovatelnosti molekuly v průběhu vibrace. Obrázek 2: Příklady Ramanských spekter plastových materiálů Typicky Ramanovo spektrum představuje tzv. “fingerprint” (otisk prstu) určité molekuly nebo materiálu, díky kterému můžeme složky daného vzorku rychle a jednoduše identifikovat a vzájemně je rozlišit. Pro usnadnění bývají často využity spektrální knihovny, které obsahují tisíce spekter, které je možné s naměřeným spektrem porovnat a tím identifikaci konkrétní látky urychlit. Intenzita spektra je přímo úměrná koncentraci měřené látky ve vzorku. Pokud je tedy provedena kalibrace závislosti mezi množstvím analytu ve vzorku a intenzitou Ramanova rozptylu, je možné používat tuto metodu i kvantitativnímu stanovení koncentrace měřené látky. 1.2. Ramanova mikroskopie Ramanova spektroskopie může být zkombinována s mikroskopickou analýzou za dosažení prostorového rozlišení v řádu 0.5–1 µm. Tím pádem je možné s velkým zvětšením vizualizovat prostorové rozložení různých složek vzorku pomocí mikroskopického laserového spotu. V případě konfokálního mikroskopu je možné analyzovat částice mikronových rozměrů či k analýze různých vrstev vícevrstevného vzorku (např. polymerní coating). Pomocí motorizované stage je možné generovat spektrální mapy, které obsahují až tisíce různých ramanských spekter z různých oblastí vzorku. Tyto spektra jsou následně zpracována a je možné vyhodnotit distribuci individuálních chemických komponent. Obrázek 3: Schéma konfokálního Ramanova mikroskopu 1.3. Příklady vzorků pro Ramanovu mikroskopii • Různé typy vzorků: pevné vzorky, prášky, tekutiny, gely, skla... • Inorganické, organické a biologické materiály • Čisté chemikálie, směsi a roztoky • Oblasti využití: o Archeologie – charakterizace pigmentů, keramiky a drahých kamenů o Uhlíkaté materiály – struktura a čistota nano-trubek o Chemie – struktura a čistota chemických látek, monitorování průběhu reakcí o Geologie – identifikace minerálů o Živé vědy – studium jednotlivých buněk nebo tkání, interakce s léčivy, diagnostické aplikace o Farmacie – uniformita složení léčivých přípravků o Polovodiče o Analýza životního prostředí – detekce kontaminantů, mikroplastů atp. 1.4. Vliv mikroplastů na životní prostředí a člověka Mikroplasty, definované jako plastové částice menší než 5 mm, jsou stále častěji detekovány v různých složkách životního prostředí, včetně vodních ekosystémů, půdy a atmosféry. Jejich přítomnost byla například prokázána v lidských tkáních, jako jsou plíce, placenta či mateřské mléko. Jejich perzistence a bioakumulativní potenciál vyvolávají obavy z možných negativních dopadů na ekosystémy a lidské zdraví. Mikroplasty vznikající buď jako primární (výroba pro kosmetiku, čisticí prostředky) nebo sekundární (degradace plastových odpadů působením UV záření, mechanického opotřebení a chemické degradace). Jejich odolnost vůči rozkladu souvisí s pevnými kovalentními vazbami polymerů a nedostatkem přirozených enzymů schopných jejich degradace. Detekce je náročná kvůli velikostní rozmanitosti a nutnosti pokročilých analytických metod (FTIR, Ramanova spektroskopie), přičemž analýzu komplikuje i kontaminace vzorků. Odstranění mikroplastů z prostředí zůstává významnou výzvou. Nedávné výzkumy naznačují, že mikroplasty mohou pronikat do mozkové tkáně savců a ovlivňovat jejich chování, což naznačuje potenciální neurotoxické účinky těchto částic (10.1016/j.jhazmat.2024.134054). Dále je známá souvislost mezi mikroplasty a kardiovaskulárním rizikem. Analýza aterosklerotických plátů odhalila přítomnost mikroplastů, přičemž pacienti s těmito částicemi měli 4,5krát vyšší riziko infarktu myokardu či cévní mozkové příhody (10.1056/NEJMoa2309822). 2. Praktická úloha – analýza směsi plastů v pitné vodě 2.1. Úvod Náročnost přípravy vzorků závisí na povaze analyzované matrice. V případě pitné vody je dostačující filtrace vzorku přes vhodný filtrační materiál s dostatečně malou velikostí pórů, která umožní zachytit mikročástice plastů. Během celého procesu je nutné minimalizovat riziko kontaminace vzorku cizorodými plasty. Proto nepoužíváme plastové materiály při manipulaci se vzorky (filtry, laboratorní nádoby, pipety), vyhýbáme se plastovým rukavicím – vhodnou alternativou jsou low-particle latexové nebo nitrilové rukavice. Filtrační membrány volíme na základě kompatibility s Ramanovskou spektroskopií, aby neovlivnily výsledná spektra. V našem případě filtrační membrána potažená stříbrem. Po přípravě vzorku provedeme analýzu mikročástic plastů pomocí Ramanovského mikroskopu. Nejprve vizualizujeme zachycené mikročástice plastů v kojenecké a filtrované pitné vodě. Použijeme optický kontrastní režim mikroskopu pro identifikaci vhodných částic k analýze. Ramanovská spektra jednotlivých částic získáme bodovou analýzou vybraných částic. Pro detailnější chemické složení vzorku provedeme vícebodové mapování napříč vybranými mikročásticemi. Pomocí specializovaného softwaru Particle analysis provedeme automatizované mapování Ramanovských spekter v rámci celého vzorku. Tento postup nám umožní přesnou identifikaci a charakterizaci mikročástic plastů na základě jejich Ramanovských spekter a napomůže k určení jejich chemického složení a distribuce ve vzorcích pitné vody. 2.2.Praktické provedení Pomůcky a chemikálie ▪ Renishaw inVia mikroskop ▪ Podložní sklíčka ▪ Oboustranná lepící páska ▪ Kovová podložka ▪ Pilník ▪ Kádinka ▪ Filtrační disk na bázi stříbra ▪ Filtrační nádoba z nerezové oceli ▪ Filtrační konvice Laica UFSBE02 MikroPLASTIK-STOP ▪ Stojan s držáky ▪ Pinzeta Příprava vzorků Vzorek č. 1 Směs plastů běžně přítomných v chemické laboratoři Vzorek č. 2 Kojenecká voda z plastové lahve Vzorek č. 3 Voda filtrovaná přes filtrační konvici 1. Pilníkem obrušujeme vzorek plastového materiálu přímo na připravenou kovovou podložku. Takto připravený vzorek č. 1 je vhodný k okamžité analýze částicovou metodou (particle analysis). 2. Připravíme filtrační aparaturu, která se skládá z odpadní lahve s upraveným víčkem, filtrační nádoby, kovové vložky a filtračního disku na bázi stříbra. Filtrační aparaturu upevníme na stojan pomocí držáků a připojíme k vakuu. 3. 100 mL kojenecké vody odměříme pomocí kádinky a postupně vlijeme do připravené filtrační nádoby. 4. Vyjmeme filtrační disk a oboustrannou páskou ho přilepíme na podložní sklíčko. 5. Takto připravený vzorek č. 2 je vhodný k okamžité analýze částicovou metodou (particle analysis). 6. 100 uL pitné vody filtrujeme přes komerční filtrační nádobu (cca 15 min). Celkový objem filtrujeme přes filtrační aparaturu stejným způsobem jako vzorek č. 2 přes nově založený filtrační disk. 7. Takto připravený vzorek č. 3 je vhodný k okamžité analýze pomocí automatické metody za použití SW Particle Analysis. Detekce mikroplastů pomocí Ramanského mikroskopu Renishaw InVia a softwaru Wire 1. Zapněte ovládací program mikroskopu - Wire 2. Vyberte vhodný objektiv (nutné přepnout i v SW) 3. Zafokusujte vzorek pod optickým mikroskopem 4. Najděte oblast nebo jednotlivé body, pro které chcete získat spektra – dle toho volba buď bodového měření nebo měření celé mapy 5. Zvolte vhodný laser (633 nebo 785 nm) 6. Nastavení měření a. Rozsah měřeného spektra b. Integrační čas c. Výkon laseru d. Počet opakování akvizice signálu e. Automatické odfiltrování signálů kosmického záření f. Automatické fokusování při měření více bodů/mapy – funkce Focus track g. Nastavení ukládání dat 7. Spuštění měření Vyhodnocení naměřených dat v SW Wire 1. Automatické odstranění pozadí měření - Substract background 2. Porovnání spektra s knihovnou a určení složení vzorky – je možné použít buď knihovnu dodanou výrobcem nebo námi vytvořenou 3. V případě měření určité oblasti je možné na základě určité hodnoty Ramanova posunu vytvořit intenzitní mapu – zjistit, jaká je distribuce určité sloučeniny v měřené oblasti na základě jejího spektra 4. Uložení spektra, export reportu Detekce vzorku mikroplastů pomocí SW Particle Analysis 1. Nejprve otevření SW Wire 2. Nastavení počátku souřadnic – Set origin 3. Pořízení optického snímku analyzované oblasti vzorku – pro větší oblast je vhodnější tzv. Montage 4. Montage – nastavení souřadnic “from - to” dle toho, jakou oblast vzorku chceme zaznamenat; možné rovněž nastavit Focus track pro automatické ostření 5. Uložení nasnímaného obrázku (bez os) 6. Otevření SW Particle Analysis 7. Import optického obrázku 8. Automatické rozpoznávání částic - dle binarizace 9. Vybrání částic, u kterých chceme změřit spektrum (např. dle velikosti) - označení částic 10. Vybrání měřícího templátu - nastavení se provede v SW WiRE a uloží se 11. Zahájení měření 12. Analýza dat – v programu WiRE, případně v Particle Analysis dle tzv. “chain metody” 13. Export reportu Výstup z praktické části úlohy: Zhodnocení složení měřených vzorků dle získaných spektroskopických dat.