C8810 Fyzikální praktikum II
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) proteinových vzorků v negativním barvení
Tematické okruhy a návod k provedení úkolů:
1. Bezpečnost práce
 seznámení se základy bezpečnosti práce s tlakovými lahvemi
 seznámení se základy bezpečnosti práce s chemikáliemi
2. Příprava vzorku pro TEM v negativním barvení
 Pro přípravu bude použit vzorek apoferritinu
 Ředění vzorku na vhodnou koncentraci (měření koncentrace proteinů pomocí absorbance při
280nm)
 Plazmové čištění TEM mřížek
 Naneste 4ul vzorku (koncentrace okolo 0.01mg/ml) na TEM mřížku
 Inkubujte 30-60 sekund
 Odsajte prebytečné množství vzorku filtračním papírem a ponořte do kapky kontrastního
barviva ( 2 % uranylacetát nebo nano-W)
 Okamžitě odsajte přebytku barviva filtračním papírkem
 TEM mřížku okamžitě položte na druhou kapku kontrastního barviva
 Inkubujte 30-60s
 Odsajte nadbytečné množství kontrastního barviva a nechte mřížku alespon 15min sušit při
laboratorních podmínkách
3. Vkládání vzorku do TEM
 Seznamte se s držákem vzorků a jeho správnou manipulací
 Vložení gridu do držáku (manipulace s pinzetou a držákem)
 Vložení držáku do mikroskopu dle standardní procedury
4. Nastavení mikroskopu pro zobrazování v jasném poli (bright field)
 Kontrola stavu vakuoveho systému mikroskopu
 Základní manipulace s mikroskopem
 Nastavení vzorku do eucentrické polohy
 Vystředění C2 kondenzorové clony
 Nastavení kondenzorových čoček (C1, C2)
 Nastavení paralelního osvětlení vzorku
 Změna intenzity paprsku při zachování paralelního osvětlení
 Stigmování objektivu
 Centrování objektivové clony
5. Snímání vzorku a optimalizace podmínek
 Vyhledání oblastí se vzorkem
 Nastavení vhodného zvětšení (např. 30 000x - 100 000x)
 Optimalizace kontrastu a zaostření (Underfocus)
 Pořízení snímků (screen capture nebo uložení na disk)
6. Optimalizace vzorku na základě získaných dat
 Zhodnočte kontrast, homogenitu a agregaci proteinů
 Diskutujte možné problémy (např. příliš vysoká koncentrace, špatné barvení, kontaminace)
 Navrhněte, jak by bylo možné vzorek vylepšit (změna pH, ředění, jiné barvivo apod.)
 Na základě získaných dat připravte nový vzorek pro zobrazování v negativním barveni
Protokol k vyplnění studenty:
Jméno studenta: ............................................
Datum: .........................................................
Použitý vzorek: ............................................
Koncentrace vzorku: .....................................
Použité barvivo: .............................................
Zaznamenaná zvětšení: ..................................
Pozorované morfologie/problémy: ....................
Kvalita snímků (kontrast, šum): .......................
Návrhy na zlepšení vzorku nebo snímání: .......