ENZYMOLOGIE Pracovní sešit k přednáškám z biochemie pro studenty biologických kombinací II ZDENĚK GLATZ 2004 2 ENZYMOLOGIE Katalýza - Berzelius 1838 katalyzátor - látky urychlující chemické reakce - nemění rovnováhu chemických reakcí - snižují aktivační energii 3 Požadavky na biokatalyzátory : A. Reakce musí probíhat cíleně. B. Musí probíhat specificky C. Jejich aktivita musí být přesně regulovaná Biokatalyzátory : ˇ globulární bílkoviny ˇ RNA - CZECH a ALTMAN (1986) Historie poznání enzymů 1878 - KUHNEN - ENZYM - En Zyme - v kvasnicích 1860 - PASTEUR - vis vitalis - životní síla v kvasinkách - LIEBIG - fermenty - chemické látky 1897 - BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení 1926 - SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa Enzymologie : ˇ studium struktury enzymů ˇ studium kinetiky enzymových reakcí ˇ studium reakčních mechanismů ˇ studium forem a lokalizace enzymů ˇ studium vztahu enzymů k patologii organismů ˇ praktické využití enzymů ˇ příprava a studium umělých enzymů Názvosloví 4 1. triviální - trypsin, pepsin, ptyalin 2. název substrátu + asa - lipasa, amylasa reakce + asa - oxidasa, hydrolasa 3. substrát + reakce - alkoholdehydrogenasa substrát1 + substrát2 + reakce - alkohol: NAD-oxidoreduktasa Enzymová nomenklatura IUB 1961 - nejnovější 1984 1. OXIDOREDUKTASY - oxidačně redukční reakce - alkoholdehydrogenasa 2. TRANSFERASY - přenos skupin - aspartátaminotransferasa 3. HYDROLASA - hydrolytické štěpení (+ H2O) - proteasy 4. LYASY - nehydrolytické štěpení (bez H2O) - karbonátanhydrasa 5. IZOMERASY - přesuny atomů a skupin - glukosafosfátizomerasa 5 6. LIGASY - vznik vazby za současného rozkladu ATP - asparaginsynthetasa EC 1.1.1.27 1. 1. 1. 27 Enzyme Commission Třída - oxidoreduktasa Podtřída - skupina CHOH Podpodtřída -koenzym NAD Číslo enzymu Vyjadřování aktivity enzymů : ˇ smluvené jednotky ˇ IU - International Unit - mezinárodní jednotka (IUB 1961) - počet mikromolů přeměněného substrátu za minutu ˇ kat - katal (IUB 1971) - počet molů přeměněného substrátu za sekundu Specifická aktivita - aktivita vztažená na mg bílkoviny Číslo přeměny - počet molů substrátu přeměněných molem enzymu za jednu sekundu 6 STRUKTURA ENZYMŮ jednoduché ENZYMY složené KOFAKTOR + APOENZYM HOLOENZYM Kofaktor - kovový ion nebo organická látka METALOENZYMY kovový ion enzym Zn2+ alkoholdehydrogenasa alkalická fosfatasa karbonátanhydrasa Mg2+ fosfohydrolasy fosfotransferasy Mn2+ arginasa Fe2+ , Fe3+ cytochromy peroxidasa katalasa Cu2+ , Cu+ tyrosinasa diaminoxidasa 7 prostetická skupina - kovalentní vazba ORGANICKÁ LÁTKA koenzym - disociabilní KOFAKTORY A VITAMINY VITAMIN - FUNK - "amin potřebný pro život" Vitamin Kofaktor Funkce rozpustné ve vodě thiamin - B1 riboflavin - B2 k.nikotinová(nikotinamid) k.pantothenová k.listová pyridoxin - B6 kobalamin - B12 k.askorbová - C biotin - H k. lipoová thiamindifosfát TPP FMN, FAD NAD+ , NADP CoA k.listová pyridoxalfosfát kobalamin k.askorbová biotin k. lipoová přenos (reakce) aldehydické s. H H acylové s. C1 skupin aminoskupiny izomerace hydroxylace COOH H rozpustné v tucích karotenoidy - A kalciferoly - D tokoferoly - E maftochinony - A proces vidění metabolismus Ca antioxidans srážení krve 8 C N O NH2 O O + CH2 O P O C N O NH2 O - O O O - O P CH2 N NN N NH2 OH OH OHOH N C O OH k. nikotinová nikotinamid NAD + NH2 O C N + - 2 [H] H + 2 [H] + H +NH2 O C N HH CH3 CH2 OH + NAD(P) + CH3 CHO + NAD(P)H + H + NIKOTINAMIDOVÉ KOENZYMY NADP + O - - O OP O O + CH2 O P O C N O NH2 O - O O O - O P CH2 N NN N NH2 OH OH OOH 9 FLAVINOVÉ KOENZYMY H3 C H3 C O O N N N NH + 2 [H] - 2 [H] H3 C H3 C O O N N N NH H H FMNriboflavin FAD CH2 O O - O PO O H OHC H OHC H OHC CH2 N NN N NH2 O O - O P OHOH N N N NH O O H3 C H3 C CH2 N N N NH O O H3 C H3 C CH2 C OHH H OHC H OHC CH2 OH N N N NH O O H3 C H3 C CH2 C OHH H OHC H OHC O - OPO O - CH2 10 Cys S Fe S Cys Cys S S Cys S S Fe N N N N CHHC CHHC Fe k.lipoová SHHS OH O C S S C O OH + 2 [H] - 2 [H] [ ]nH CH3 H3 CO H3 CO O - O . [ ]nH CH3 H3 CO H3 CO O - O - [ ]nH CH3 H3 CO H3 CO O O + 2 e - + 1 e - + 1 e - - 2 e - - 1 e - - 1 e - ubichinon ferredoxiny hem glutathion 2 GSH GSSG + 2 [H] - 2 [H] 11 AdeP + P P + R S + CH3 RibRib AdePPPR O + N NN N NH2 OHOH CH2 O S + CH3 - OOC CH NH3 + CH2 ATP adenosylmethionin aktivní sulfát NH2 O O - O P N NN N OHO CH2 O O - O O O S O P O - O - R S CH3 R OH R OH R COOH O O P O O - O O O - O P CH2 N NN N NH2 OH OH O - O P - O +PP Rib AdePR OC O PR O +P Rib AdeP 12 biotin CH2 H2 N OH N NN N NH2 C CH2 H2 N OH N+ NN N NHC tetrahydrolistová k. methylentetrahydrolistová k. methenyltetrahydrolistová k. N N CH3 CH2 NH2 H3 C N S CH2 CH2 OH + CH3 CH2 N S CH2 O P P C CH3 HO H + thiamin NHN S O COOH - OOC NHHN S O COOH + CO2 + ATP CH CH2 COOH COOH CH2 N N N N OH H2 N CH2 NH C O NH HH 13 OHOH N NN N NH2 CH2 O O - O PO O - O PO O HS CH2 CH2 NH C O O C NHCH2 CH2 C H HO C CH3 CH3 CH2 koenzym A - CoA - CoASH H N C OH OH CH3 H2 CP + C NH2 COO - R H N C H OH CH3 H2 CP C N COO - R pyridoxalfosfát OHOH CH2 O O - O PO O - O PO O NH2 N NON + CH2 CH3 H3 C CH3 CH2 cytidindifosfát OHOH CH2 O O - O PO O - O PO O OH N NO O CH2 OH OH OH O H H H H OH CoASH + RCOOH CoAS C R O + H2 O uridindifosfát 14 Lyasy a ligasy - bez kofaktoru nebo již popsaným kofaktorem TPP Hydrolasy - bez kofaktoru Izomerasy - většinou bez kofaktoru nebo kobalamin, Regenerace kofaktorů 1. Prostetická skupina se regeneruje na téže enzymové bílkovině : alanin PLP k.glutamová pyruvát PLPNH2 k.ketoglutarová 2. Koenzym se odštěpí napojí se na jiný apoenzym a regeneruje se v jiné enzymové reakci : alkohol + NAD+ aldehyd + NADH pyruvát + NADH laktát + NAD+ Enzymové bílkoviny ˇ monomerní ˇ oligomerní ˇ multienzymové komplexy Aktivní místo enzymů katalytické Aminokyseliny vazebné strukturní 15 Fischer - 1894 - teorie o zámku a klíči Koshland - 1959 - teorie indukovaného přizpůsobení 16 17 Specifita enzymové reakce specifita reakční - účinku - jaká reakce proběhne specifita substrátová - absolutní - skupinová - stereospecifita ENZYMOVÁ KINETIKA Reakce s jedním substrátem BROWN 1902 MICHAELIS MENTENOVÁ 1913 a) závislost počáteční rychlosti na koncentraci enzymu vo [E] 18 b) závislost počáteční rychlosti na koncentraci enzymu vo [S] V/2 V Rovnice Michaelis Mentenové v = V . [S] Km + [S] v - počáteční reakční rychlost V - maximální (limitní) reakční rychlost Km - Michaelisova konstanta [S]>>Km v = V . [S] [S] = V v = V . [S] Km + [S] [S]< Km Vi = V Nekompetitivní inhibice E + I EI EA + I EAI 1/vo 1/[S]1/Km 1/V 1/Vi Kmi = Km Vi < V 22 Fyzikálně chemické faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce Vliv pH Aktivita pH pH optimum Vliv teploty log k 1/T teplotní optimum 23 Regulace činnosti enzymu ˇ Regulace koncentrace enzymu ˇ Allosterická regulace MONOD 1963 ˇ Regulace zpětnou vazbou ˇ Regulace kovalentní modifikací ˇ Kompartmentace Využití enzymů ˇ bioanalytická chemie - stanovení substrátů - stanovení inhibitorů - nepřímé stanovení ˇ lékařství ˇ průmyslové využití ˇ průmyslové využití - prací prostředky - krmivářství - potravinářství - farmacie ˇ enzymová katalýza v organické chemie Umělé enzymy ˇ Synzymy ˇ Abzymy