Konfokální mikroskop confocal laser scanning microscope (CLSM) Historie • Minský M. (60. léta 20. století) • Petráň M. a Hadravský M. (1967) - konstrukce konfokálního mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče • rozvoj od konce 70. let 20. století - laserový paprsek, počítač • dvou (multi-) fotonový mikroskop Confocal - conjugate (sbíhat) + focal (ohniskový) obě donkyjsou umístěny v ohniscích Scanning c ican Size i • La sei- i Spot^ -■ .'■ l s r' d ■■ %W / > - --- 'J C )bj ec five's Fie of View x lei 16x16 Pixels Microscop (internet) Schéma současného konfokálního mikroskopu (s rozmĺtaným laserovým paprskem) (Vesmír, 1995) ( Bäseiŕ jfc cip konfokalniho mikroskopu konfokální clonka 0 paprsky z ohniskové roviny ..... ohnisková rovina O paprsky z mimoohniskových rovin ..... mimoohniskové roviny Konfokální mikroskop na bázi Nipkowova kotouče (internet) Využití světla pro CLSM • reflexe - textura a složení povrchů - elektronických součástek, studium neuronových sítí (pomocí Ag), ... • difúze • fluorescence - struktura buňky a tkání, studium metabolických drah, ... Výhody CLSM • odstranění mimoohniskových rovin • vysoký kontrast obrazu • neinvazní metoda • zachování prostorového uspořádání • schopnost vytvoření prostorové rekonstrukce • digitální forma výstupu - rotace, perspektiva, ... • schopnost zobrazení buňky - tkáně - mnohobuněčného organismu • současné použití až 4 kanálů + procházející světlo Nevýhody CLSM • délka zpracování materiálu i snímků =>,,vyhasínání fluorescence" • neostré snímky při nízké intenzitě fluorescence • pořizovací cena (mikroskop, konfokální nástavec, počítač + program) snímek z digitálního fotoaparátu snímek z konfokálního mikroskopu Srovnání 3 metod užívaných ve fluorescenční mikroskopii (Lacey, 1999) Dvoufotonová mikroskopie • absorbce 2 fotonů fluorochromem ve stejném okamžiku => záření s dvojnásobnou vlnovou délkou (poloviční energie) => excitační záření 700 nm (červená) => emitované záření 900 nm Výhody • se zvyšující se intenzitou záření zdroje se zvyšuje pravděpodobnost absorpce 2 fotonů fluórochromem • excitace fluorochromu jen v zaostřené rovině => odpadá nutnost konfokální clonky => maximum světla • velká vlnová délka (700 nm) => pomalejší „vyhasínání" menší rozptyl světla ve vzorku větší penetrace světla ve vzorku malá fototoxicita (x U V záření) Nevýhody • cena Ti Sapphire laseru • ohřev vzorku => užití laserových pulsů než plynulé ozáření Srovnání konfokální a 2-fotonové mikroskopie konfokální 2-fotonové | | oblast excitace • pozorovaná oblast Konfokální mikroskopy TCS SP2 Olympus Fluoview 500 • optické řezy v rovinách XY, XYZ , XZY • schopnost zaznamenat změny i v časové rovině XYt, XYZt • současné snímání obrazu v procházejícím a fluorescenčním světle • použití 4 kanálů zároveň • sekvenční snímání • volitelnost rychlosti a typu rastrování => kvalita snímku • kompenzace šumu, zesíleni signálu • 3D rekonstrukce obrazu a rotace vazba aktin-faloidin (FITC) vazba aktin-faloidin (TRITC) vazba tubulin-protilátka (FITC) vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI neuron, vazba mikrotubulové proteiny-protilátka (Texas-RED) 1 > vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI vazba mitochondrie-mitotracker red ^^» fluorescence Gomoriho trichromu ^•J Internetová odkazy http://137.120.28.214/cslm/lpath.mpg http://www.microscopyu.com/articles/confocal/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/confocal/index.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/iava/multiphoton/excitationbleaching/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/iava/confocal/index.html http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html http://www.lob.polytechnigue.fr/themes/imagerie fonctionnelle/Anim celU small.gif