Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Fluorescence Fluorescence je jev, kdy látka absorbuje ultrafialové záření nebo viditelné světlo s krátkou vlnovou délkou a emituje viditelné světlo s delší vlnovou délkou než má světlo absorbované Emitace světla není doprovázena tepelným zářením Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Fluorescence Třístupňový proces : 1. fáze - excitace (buzení viditelného záření) 2. fáze - vlastní doba excitovaného stavu (nevratná přeměna části energie v jiné druhy) 3. fáze - emise (vyzáření světla určité vlnové délky) Energie excitovaného světla je větší než emitovaného (Eex> Eem) Vlnová délka excitovaného světla je menší než emitovaného (A,ex< A,em) (EeX)S1^^2. 1.1 3. Em e So Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Fluorescence má některé typické vlastnosti. Některé z nich jsou obzvlášť důležité pro fluorescenční mikroskopii. • Aby látka emitovala fluorescenční světlo, musí světlo absorbovat. • Vlnová délka fluorescenčního světla lambdaem je obvykle větší, než vlnová délka excitačního světla 1ex (Stokesův zákon). Delší vlnová délka odpovídá menší energii světla. To znamená, že energie fluorescence je menší, než energie absorbovaného světla. • Intenzita fluorescence je obecně mnohem menší, než intenzita excitačního světla. • Fluorescenční světlo je emitováno všemi směry nezávisle na směru excitačního světla. • Fluorescence postupně mizí. • Každá látka má své charakteristické fluorescenční spektrum. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Každá látka má své charakteristické fluorescenční spektrum Spektrum tzv. bílého světla Neviditelné ultrafialové UV i viditelné světlo Neviditelné infračervené IR i 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 (nm) Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Fluorescenční mikroskop V r. 1910 pozoroval Koehler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha objektů První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl v r. 1913, na jeho zkonstruování se podíleli Koehler, Reichert a Lehman Fluorescenční mikroskopie: epifluorescence - pozorování v odraženém světle diafluorescence - pozorování v procházejícím světle, která se v současné době téměř nepoužívá Nyní pod pojmem fluorescence rozumíme výhradně pozorování odraženého fluorescenčního světla. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Schéma fluorescenčního mikroskopu 2 1- schránka s výbojkou Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE UV Modrá Neabsorbov.-ii-r: modrá ; r \ Fluor&Ecenců (žlutá) IR Suételný zdroj Excitační filtr Fluorescenční preparát Bariérový filtr Pozorování nebo mikrofotografie 1. Světelný zdroj: mikrototogratie | světlo s různými 2. Excitační filtr: Ze světelného zdroje vychází s vlnovými délkami od UV po IR. Tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. 3. Fluorescenční preparát: Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barviva -fluorochromu). 4. Dichroické zrcátko: 5. Bariérový filtr: Slouží k oddělení excitačního a fluorescenčního (emitovaného) světla. Tento filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Schéma principu fluorescenční mikroskopie Kostka s filtry a zrcátkem 1. Rtuťová výbojka 2. Excitační filtr 3. Dichroické zrcátko 4. Objektiv Preparát Bariérový filtr Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Světelný zdroj: - musí emitovat dostatečně intenzivní světlo o blízkých ultrafialových vlnových délek 1. Vysokotlaké rtuťové výbojky - v trubici z křemenného skla je malé množství inertního plynu a rtuti. 2. Xenonová výbojka - oproti rtuťové výbojce má spojité spektrum od ultrafialových délek po blízké infračervené vlnové délky. V oblasti viditelného světla se tato výbojka blíží přírodnímu dennímu světlu. 3. Halogenové žárovky - využívají rozžhavené wolframové vlákno, jsou známé u běžných mikroskopů. Lze použít u těch fluorescenčních aplikací, kde není potřeba zdroj ultrafialového světla. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Filtry: - k excitaci se používá pouze část ze spektra světelného zdroje a k pozorování fluorescence se používá část fluorescenčního spektra; proto hrají filtry ve fluorescenční mikroskopii tak důležitou roli 1. Interferenční filtry Lze je vyrábět pomocí vakuovaného naparování. Tyto filtry využívají k filtraci různých vlnových délek interferenci světla na rozhraní vrstev s různými indexy lomu (dichroické zrcadlo, excitační filtr). 2. Filtry z barevného skla - Tento typ filtrů se vyrábí přidáním pigmentu do skla. Tyto filtry jsou díky absorbci světla propustné pouze pro část spektra (bariérový filtr). Kombinací zmíněných typů filtrů se ve fluorescenční mikroskopii dosáhne požadovaných vlastností systému filtrů Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Oddělení excitačního a fluorescenčního světla pomocí dichroického zrcadla Dichroické zrcadlo je druh interferenčního filtru a umístí-li se do optické dráhy v úhlu 45°, kratší vlnové délky odráží a delší jím prochází. Hlavní předností dichroického zrcátka je velká efek oddělení excitačního efektivita oddělení excitač fluorescenčního světla. Účinnost odrazu excitačního světla je více než 90 % a účinnost průchodu fluorescenčního světla je také větší než 90%. Celková účinnost oddělení je j /o. oelková učiiirios tedy větší než 80%. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE K úplnému oddělení excitačního a fluorescenčního světla je v reálných systémech nutné přidání bariérového filtru, a to z ná důvodů: následujících část excitačního světla se odráží od u čoček a povrchu vzorku povrch • velká část excitačního světla je sice odražena část světla st excitačního světla je směrem ke zdroji, ale dichroickým zrcadlem projde , které má vlnovou délku, pro zrcadlo propustné kterou je dichroické Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE 1. Pozorování autofluorescence (bez použití barviva) Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE 2. Pozorování sekundární fluorescence (metoda chemického barvení) Pozorování fluorescenčního světla generovaného fluorochromem (=próba, fluoreskující barvivo), kterým se obarví látka bez vlastní fluorescence (proteiny, uhlohydráty). Pokud se obarví pouze objekty, které chcete pozorovat, lze je pozorovat odděleně od tkáně a ostatních pozoro buněk. Chromozomy propidium jodid fluoreskující díky Aplikace: vizualizace buněčných jader, chromozómů, cytoskeletu, buněčných stěn atd. Barvení DAPI jádra kvasinky Saccharomyces cerevisiae Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE 3. Fluorescenční barvení protilátek (imunofluorescence) olekuly protilátky, označené navázaným fluorochromem, se váží s molekulami specifickým buněčným antigenů za vzniku komplexů (antigen+ protilátky + fluorochrom) Vizualizace specifických antigenů, provázejících určité choroby, jejichž množství respektive přítomnost se studuje po reakci antigen/protilátka Nepřímá imunofluorescence Zeleně (FITC) fluoreskují buněčné struktury positivní na antigen prokazovaný protilátkou 2E12 (apoptotické buňky). Červeně fluoreskují buňky, do nichž porušenou buněčnou membránou proniklo fluorescenční barvivo propidium jodid, který se váže na buněčnou DNA. Toto barvivo neproniká membránou živých buněk a barví pouze buňky v pozdní fázi apoptózy a buňky nekrotické. Na obrázku jsou zviditelněné apoptotické buňky a apoptotická tělíska, které se barví zeleně, dále buňky nekrotické barvící se červeně a též buňky v pozdní fázi apoptózy barvící se oběma fluorochromy. Zoologická mikrotechnika - FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE Příklady fluochromů: 1. Skupina - nekovalentně se váží přímo na určité struktury v buňce - např. DNA - akridinová oranž, propidium jodid, ethidium bromid, DAPI 2. Skupina - váží se např. na protilátku a přes ni na určitou buňku - Texas Red, FITC (fluorescein isothiokyanát), TRITC,(tetramethylrhodamin isothikyanát) Při fluorescenční mikroskopii je nutno používat podložní skla, krycí skla, uzavírací médium a imerzní olej bez primární fluorescence, tzn. že v použitém excitačním záření samy nefluoreskují