Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA Znalost přesné koncentrace DNA je podmínkou úspěšného provedení ředy molekuláměbiologických metod, jako transformace, transfekce, enzymové reakce s DNA při štěpení restrikčními endonukleázami a klonování, mapování, sekvencování a pod. Spektrofotometrické stanovení je založeno na poznatku, že roztoky DNA pohlcují UV záření. Záření je pohlcováno pyrimidinovými a purinovými bázemi DNA. Dochází k excitaci jejich chemických vazeb, což má za následek postupnou degradaci DNA. Absorpční maxima jednotlivých nukleotidů se navzájem poněkud liší: dATP ... 259 nm, dCTP ... 271 nm, dGTP ... 253 nm, dTTP ... 267 nm. DNA absorbuje maximálně UV záření o vlnové délce 260 nm. Množství pohlceného UV záření je přímo úměrné koncentraci DNA v roztoku a vyjadřuje se hodnotami absorbance: 4 = log-£ kde I o j e množství vcházejícího světla a/je množství světla propuštěného. Nejpřesnější je stanovení absorbance v rozmezí od 0,1 do 1,0. Při stanovení koncentrace DNA platí následující vztahy: ds DNA A26o = 1 odpovídá 50 ug/ml ss DNA A26o = 1 odpovídá 33 ug/ml jednořetězcové oligonukleotidy A26o = 1 odpovídá 20 ug/ml (ss RNA A26o = 1 odpovídá 40 ug/ml) Tyto vztahy platí pro optickou dráhu 1 cm (tj. šířka kyvety). Jako rozpouštědla se při spektrofotometrickém stanovení koncentrace DNA používá obvykle destilované vody, TE pufru, S SC pufru nebo fosfátového pufru. Výhodou spektrofotometrického stanovení je jeho přesnost a současná možnost posoudit čistotu preparátu. Čistotu DNA lze stanovit z poměrů absorbancí při různých vlnových délkách. Pro čistou DNA platí tyto hodnoty: A280/A26o = 0,550 A26o/A28o = 1,80 až 1,85 A230/A26o = 0,455 A260/A23o = 2,20 Pro čistou RNA platí poměr: A26o/A28o = 2,0. Při kontaminaci preparátu proteiny jsou vypočtené poměry absorbancí výrazně nižší a koncentraci DNA nelze přesně stanovit. Stupeň znečištění DNA lze posoudit rovněž proměřením absorbance vzorku v rozsahu vlnových délek 230 - 300 nm a vyhodnocením získané křivky. V případě silného znečištění DNA je třeba provést její přečištění. Podle toho čím je DNA znečištěna použije se některý z níže uvedených postupů: - odstrannění fenolu: dialýza, extrakce chloroformem - odstranění proteinů: opakovaná deproteinace chloroformem. Lze použít rovněž enzymové degradace proteinů pomocí pronázy nebo proteinázy. - odstranění RNA: enzymová degradace pomocí RNázy nebo specifické precipitační postupy. Stanovení koncentrace DNA fluorescenční metodou Metoda se používá u vzorků s nízkou koncentrací DNA a u vzorků znečištěných jinými látkami Princip metody je založen na základě fluorescenčního záření emitovaného etidiumbromidem navázaným na DNA. Toto barvivo interkaluje mezi báze v dvouřetězcové DNA a po ozáření UV světlem silně fluoreskuje (asi 80x intenzivněji než volné barvivo). Srovnáním intenzity záření (o vlnové délce 590 nm) emitovaného testovaným vzorkem DNA a vzorkem standardní DNA o známé koncentraci lze stanovit koncentraci neznámého vzorku DNA. Tímto způsobem lze zjistit množství 1 - 5 ng DNA. Upozornění! Etidiumbromid je silný mutagen. Při práci s jeho roztoky je nutné pracovat v rukavicích a dodržovat zásady bezpečnosti! Postup: Vzorek DNA o neznámé koncentraci naředíme v TE-pufru ve sterilních mikrozkumavkách lOx, 50x, lOOx, 1 OOOx , 10 OOOx a 100 OOOx. Z jednotlivých ředění odebereme automatickou pipetou 5 ul a přeneseme je na parafilm, kde se vytvoří malá kapka. K této kapce přidáme 5 ul roztoku etidiumbromidu (2 ug/ml v TE-pufru ) a špičkou pipety oba roztoky promícháme. Paralelně ke kapkám vzorku připravíme stejným způsobem kapky standardního vzorku DNA se známou koncentrací. Parafilm s kapkami přeneseme na povrch T1VT transiluminátoru (2UV Transilluminator, UVP,UK) 302 a 365 nm) a srovnáváme intenzitu fluorescence. Lze pořídit fotografický snímek a odečíst výsledek. Schema pokusu: ŘEDĚNÍ 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Standard (DNA) 0 lOx 50x lOOx lOOOx 10 OOOx 100 OOOx Vzorek (DNA) 0 lOx 50x lOOx 1000 10 OOOx 100 OOOx EB (nl)+DNA (ul) 5 + 5 5 + 5 5 + 5 5 + 5 5 + 5 5+5 5 + 5 Zdroj UV (nm) 302 302 302 302 302 302 302 Standard+EB(10 |al) • • O m m © O Vzorek+EB (10 jal) O • o m m O o v Štěpení DNA restrikčními endonukleázami Každý reštrikční enzym vyžaduje optimální reakční podmínky, které jsou uváděny výrobcem v katalogu nebojsou uvedeny v literatuře. Hlavní faktory, které výrazně ovlivňují rychlost a specifičnost štěpení, jsou teplota a složení reakčního pufru. Zatímco požadavky na teplotu jsou většinou dosti vyhraněné, rozdíly ve složení pufrů bývají často malé. Proto lze pro určitou skupinu restrikčních enzymů používat stejného pufru. Podle složení restrikčních pufrů lze enzymy rozdělit do tří základních skupin, a to na enzymy které pracují při nízké, střední a vysoké iontové síle pufru. Složení těchto pufrů je následující: ______________ Pufr NaCl Tris.Cl (pH 7,5) MgCl2 nízká iontová síla 0 10 mM 10 mM střední iontová síla 50 mM 10 mM 10 mM vysoká iontová síla 100 mM 50 mM 10 mM Obvykle jsou výše uvedené pufry připravovány jako 10x koncentrované zásobní roztoky, které se skladují při -20 °C. Provedení vlastního štěpení DNA Reakce se obvykle provádí s 0,2 - 1 ug DNA v celkovém objemu 20 ul reakční směsi. Postup: 1. Roztok DNA smíchat ve sterilní Eppendorfově zkumavce se sterilní destilovanou vodou tak, aby množství DNA bylo 0,2 - 1 |xg a celkový objem 18 jj.1. 2. Přidat 2 jLxl příslušného 10x koncentrovaného restrikčního pufru a dobře promíchat. 3. Přidat jednu jednotku restrikčního enzymu a dobře promíchat. Jednotka enzymu je obvykle definovaná jako množství enzymu vyžadované pro rozštěpení 1 (xg DNA kompletně během jedné hodiny v doporučeném pufru a při doporučené teplotě v 20 ja.1 reakční směsi. 4. Inkubovat po příslušnou dobu za příslušné teploty. 5. Zastavit reakci přidáním 0,5 M EDTA do konečné koncentrace 20 mM. Reakci lze zastavit rovněž zahřátím reakční směsi na 65 °C po dobu 10 min. Pokud má být DNA analyzována přímo na gelu, přidat nanášecí barvivo (5:1) na nanést na gel. 6. Jestliže štěpená DNA má být purifikována, extrahovat lx fenol: chloroformem, 1 x chloroformem a vysrážet DNA etanolem. Poznámky k práci s restrikčními enzymy Reštrikční enzymy jsou drahé, proto je třeba dodržovat následující pravidla: 1. Reštrikční enzymy jsou stabilní při -20 °C, proto s nimi mimo tuto teplotu manipulujeme co nejkratší dobu a v ledové lázni. 2. Odběr požadovaného množství provádíme vždy novou sterilní špičkou. Kontaminace enzymu vede k jeho degradaci. 3. Často je možné množství enzymu vyžadovaného pro štěpení snížit a prodloužit dobu štěpení. 4. Pokud má být DNA štěpena dvěma nebo více enzymy, lze štěpení provést současně (pokud reakční pufr pro oba enzymy je stejný), nebo následně: nejdříve enzym vyžadující nízkou iontovou sílu, pak koncentraci pufru upravit a provést štěpení dalším enzymem. 5. Jestliže je prováděno štěpení mnoha vzorků DNA, vypočtěte celkové potřebné množství enzymu. Odeberte toto množství a smíchejte s příslušným restrikčním pufrem. Rozplňte příslušné díly do jednotlivých reakčních směsí. 6. Jestliže objemové množství DNA je vyšší než kapacita jamky v gelu, je možné DNA zkoncentrovat etanolem a rozpustit v TE pufru. Reštrikční endonukleazy (zkr. restriktázy, RE) sekvenčně specifické endonukleazy štěpící fosfo-diesterovou vazbu dsDNA v určité sekvenci nukleotidů Původ: Převážně produkty bakterií. V současné době je známo více než 3000 restriktáz, které rozpoznávajících 150 různých sekvencí Názvosloví: např. EcoRI * 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie (kurzíva) * 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie (kurzíva) * označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) * římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleazy izolované z dané bakterie Funkce: odbourávání cizorodé DNA (např. DNA fágů) Typy RE : I, II a III Typ II: má na dsDNA shodné rozpoznávací místo (4-8 bp) s místem štěpení. Výsledek štěpení: RE-fragmenty DNA různé velikosti 3 typy RE-fragmentů: a) s tupými konci b) přesahujícími 5- konci c) přesahujícími 3- konci IZOSCHIZOMERY: různé RE, které mají stejné cílové sekvence (odlišní producenti, většinou stejná reakce). Izoschizomery mohou mít odlišnou citlivost k metylovaným bažím v cílové sekvenci IZOKAUDAMERY: Různé RE, které mají odlišné cílové sekvence, ale vytvářejí stejné lepivé konce. To je výhodné pro cílené spojování různých molekul DNA. EcoR\ má relaxovanou specifitu (může štěpit DNA v blízce příbuzných sekvencích při neoptimálních podmínkách) 5 GAATTC 3 5 GGATTC 3 5 GGATTT 3 5 AGATTT 3 Reštrikční enzymy se speciálními teplotami inkubace Acs\ (50 °C) BstEU (60 °C Acy\ (50 °C) BsfX\ (45 °C Apa 1 (30 °C) Dsa\ (55 °C Bani (50 °C) Mae I (45 °C Bcl\ (50 °C) MaeW (50 °C Bsek\ (55 °C) Mae II! (55 °C ßs/WI (55 °C) Sfi\ (50 °C Bs/Y\ (55 °C) Sma\ (25 °C Bsm\ (65 °C) SspB\ (50 °C Bsp LU11 (48 °C) Swa I (25 °C Bss Hll (50 °C) Taq\ (65 °C Využití restrikčního štěpení: RE-spektra, molekulární typizace RE-fyzikální mapy Molekulární sondy - hybridizační sondy klonování Jednotka enzymu =množství RE, které rozštěpí 1 jug dsDNA (obvykle DNA fága X) za 1 hod. při optimální teplotě a optimálních podmínkách uvedených pro každou RE Příprava štěpící směsi - objem 20 jíl mžiková centrifugace 12 tis. rpm/ čas 0 inkubace při 37 °C 1,5 hod zastavit reakci přidáním 0,8 jíl (0,5M EDTA) Příklady několika restrikčních enzymů, jejich rozpoznávací sekvence a místa, ve kterých probíhá štěpení DNA Restriktáza Rozpoznávací sekvence 5'nnnnn3' 3'nnnnn5' Eco RI E. coli B 55 G|AATTC CTTAAIG C/a I Caryophanon latum AT|CGAT TAGCITA Apa I Acetobacter pasteurianus GGGcqc qCCGGG Bst Ell Bac. stearothermophillus G|GTNACC CCANTGIG Hind II Haemophilus influenzae GTPy|PuAC CAPu|PyTG Pvul Proteus vulgaris CGAT|CG GCITAGC Pvull Proteus vulgaris CAG|CTG GTC|TAG Srna I Serratia marcescens CCC|GGG GGGICCC Accl Acetobacter calcoaceticus GT|ATAC GT|AGAC GT|CTAC GTICGAC Ban II Bacillus aneurinolyticus GAGCqC GAGCT|C GGGCC|C GGGCTIC