Příprava preformovaného sacharózového gradientu pro ultracentrifugaci
Ultracentrifugace je separační metoda používaná v molekulární biologii k identifikaci, izolaci,
purifikaci a charakterizaci biomakromolekul, buněčných organel, virů apod. Na rozdíl od
klasické nízkoobrátkové centrifugace se ultracentrifugací rozumí odstřeďování při vysokých
otáčkách, tj., při 20 000 - 100 000 ot/min. Vysokému počtu otáček je přizpůsobena konstrukce
ultracentrifugy; nutné je intenzívní chlazení a snížení atm. tlaku v rotorovém prostoru. Rotory
jsou vyrobeny z ušlechtilých materiálů, centrifugační zkumavky jsou vyrobeny z hmot
odolávajících vysokému přetížení a vzorek ve zkumavce je hermeticky uzavřen. Nutné je
přesné vyvážení protilehlých centrifugačních zkumavek (přesnost hmotností se pohybuje
řádově v jednotkách mg.)
Z hlediska účelu lze centrifugaci rozdělit na:
a) preparativní, kdy cílem je izolace nebo purifikace biomakromolekul.
b) analytická, kdy cílem je identifikace případně charakterizace dané částice (např. stanovení
její velikosti (mol. hmotnosti), sedimentačního koeficientu, vznášivé hustoty apod.).
V obou případech je možné podmínky centrifugace zvolit tak, aby dělení částic probíhalo buď
v závislosti na jejich velikosti, nebo v závislosti na jejich hustotě.
Pokud mají být navzájem odděleny částice lišící se navzájem svou velikostí (molekulární
hmotností), probíhá centrifugace většinou v tzv. sacharózových gradientech, tj. v roztocích
sacharózy, jejichž koncentrace u dna centrifugační zkumavky je vyšší než u hladiny.
Nejčastěji se používají lineární gradienty 5 - 20% sacharózy. Vzrůstající hustota roztoku a tím
i jeho viskozita eliminují odstředivé zrychlení působící na částice, jehož hodnota se směrem
od osy otáčení zvyšuje. Gradient tak zajišťuje konstatní rychlost sedimentace částic,
podmiňuje jejich stabilitu a snižuje difúzi usazených částic do okolí. K přípravě gradientů lze
použít rovněž dalších látek, např. D2O, ficoll aj.
Sacharózových gradientů se velmi často používá pro stanovení molekulárních hmotností
DNA a proteinů. V případě, že mají být vzájemně odděleny částice na základě své odlišné
specifické hustoty, používá se gradientů chloridu cesného. Roztoky CsCl se vyznačují
vysokou hustotou a při centrifugaci samovolně vytvářejí koncentrační a tím i hustotní
gradient. Gradient je určen počáteční koncentrací CsCl a rychlostí otáčení. K ustálení
gradientu dojde během několika hodin.
Biomakromolekuly, které se na počátku centrifugace promíchají s roztokem CsCl, se při
centrifugaci usadí ve vrstvě roztoku (gradientu), odpovídající jejich vznášivé hustotě (její
hustota je poněkud odlišná od specifické hustoty).
Detekce biomakromolekul po centrifugaci.
V případě preparativní ultracentrifugace lze částice detekovat vizuálně, jako opalescenční
pruhy uvnitř zkumavky. tyto lze pak odebrat (např. injekční stříkačkou) a dále zpracovat.
V případě analytické centrifugace se obsah zkumavky po centrifugaci rozdělí na jednotlivé
frakce (např. vykapáním) a každá frakce se odděleně analyzuje z hlediska fyzikálních
vlastností (tj. hustota, absorbance, radioaktivita, index lomu apod.). Číslo frakce udává
současně i její vzdálenost od povrchu (dna) zkumavky a tím i od středu otáčení. Srovnání
fyzikálních veličin jednotlivých frakcí umožní pak identifikovat polohu částic v gradientu a
blíže je charakterizovat.
Příprava preformovaného gradientu sacharózy
A-postup:
Gradienty sacharózové 5 - 20 % neutrální
Připravte po 100 ml zásobních roztoků sacharózy o koncentraci 5, 8, 12, 16 a 20 %.
Neutrální sachróza: 0,01M Tris.HCl, pH 7,5
1 M NaCl
0,001M EDTA pH 8,0
5 % (8, 12, 16 nebo 20 %) w/v sacharóza
Sterilizujte 12 min / 121 °C
Pozn.: Obvykle se připraví zásobní 20 % roztok sacharózy a z tohoto roztoku se naředí roztokem pro ředění
sacharózy (1 M NaCl, 0,001M EDTA, 0,01M Tris.HCl, pH 7,5) 16 %, 12 %, 8 % a 5 % roztoky. Koncentraci
takto připravených roztoků se zkontroluje refraktometricky.
B-postup:
Gradienty sacharózové 5 - 20 % alkalické
Připravte po 100 ml zásobní roztoky sacharózy o koncentraci 5, 8, 12, 16 a 20 %.
Alkalická sachróza: 0,1M NaOH
0,9 M NaCl
0,001M EDTA pH 8,0
5 % (8, 12, 16 nebo 20 %) w/v sacharóza
Vlastní vrstvení gradientu:
Do 5 ml centrifugační zkumavky naneste 0,8 ml 16% roztoku, který podvrstvěte 0,8 ml 20%
roztoku, ostatní roztoky (12 %, 8 % a 5%) navrstvujte po 0,8 ml. Jako další vrstvu naneste 0,2
ml detergentu (SDS nebo Nonidet v EDTA-citrátu) pro usnadnění vstupu vzorku do
gradientu. Potom naneste 0,2 ml vzorku smíchaného s roztokem EDTA-citrátu. Vzorek
převrstvěte 0,5 ml sterilního parafinového oleje.
Příprava preformovaného gradientu CsCl
Příprava roztoků CsCl (100 ml) v pufru SM
Koncentraci je nutno upravit na základě měření indexu lomu
Odběr frakcí po ultracentrifugaci v hustotním gradientu
Příprava preformovaného sacharózového gradientu
1) Připravit zásobní 5, 15, 25, 35 a 45% roztoky sacharózy (w/v)
2) Zkontrolovat koncentraci zásobních roztoků refraktometricky, změřit
index lomu
3) 15 a 35% roztoky obarvit safraninem nebo krystalovou violetí
4) Vrstvení gradientů: a) převrstvováním
b) podvrstvováním
Vzorek Koncentrace
% (w/v)
Koncentrace
stanovená na
refraktometru
% (w/w)
Index
lomu
nD
25
Hustota
25
(při 25 °C)
1 5
2 15
3 25
4 35
5 45
ÚKOLY
1) Do tabulky vyplnit hodnoty koncentrací a indexu lomu zjištěných
refraktometricky
2) Vypočítat hustotu podle vztahu
25 = 10,8601 × nD
25
­ 13,4974 [g/cm3
]
Nomogram pro přepočet relativní odstředivé síly (RCF)
a otáček rotoru (rpm)
r [cm] n (rpm) [min-1
]
RCF = relativní odstředivá síla
r = vzdálenost od středu otáčení
(poloměr rotoru) v cm
n = počet otáček za minutu (rpm)
RCF [×g]
Relativní odstředivou sílu (tzn. kolikrát je v určité vzdálenosti od osy
rotoru při zvolených otáčkách odstředivá síla větší než gravitační síla)
dovoluje vypočítat vzorec:
RCF = 1,119 . 10-5
n2
r