QIAquick Spin Handbook 07/2002
QIAquick Gel Extraction Kit Protocol
using a microcentrifuge
This protocol is designed to extract and purify DNA of 70 bp to 10 kb from standard or
low-melt agarose gels in TAE or TBE buffer. Up to 400 mg agarose can be processed per spin
column. This kit can also be used for DNA cleanup from enzymatic reactions (see page 8).
For DNA cleanup from enzymatic reactions using this protocol, add 3 volumes of Buffer
QG and 1 volume of isopropanol to the reaction, mix, and proceed with step 6 of the
protocol. Alternatively, use the new MinElute Reaction Cleanup Kit.
Notes: ˇ The yellow color of Buffer QG indicates a pH 7.5.
ˇ Add ethanol (96­100%) to Buffer PE before use (see bottle label for volume).
ˇ Isopropanol (100%) and a heating block or water bath at 50°C are required.
ˇ All centrifugation steps are carried out at 13,000 rpm (~17,900 x g) in a
conventional table-top microcentrifuge.
ˇ 3 M sodium acetate, pH 5.0, may be necessary.
1. Excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean, sharp scalpel.
Minimize the size of the gel slice by removing extra agarose.
2. Weigh the gel slice in a colorless tube. Add 3 volumes of Buffer QG to 1 volume of
gel (100 mg ~ 100 l).
For example, add 300 l of Buffer QG to each 100 mg of gel. For >2% agarose
gels, add 6 volumes of Buffer QG. The maximum amount of gel slice per QIAquick
column is 400 mg; for gel slices >400 mg use more than one QIAquick column.
3. Incubate at 50°C for 10 min (or until the gel slice has completely dissolved). To help
dissolve gel, mix by vortexing the tube every 2­3 min during the incubation.
IMPORTANT: Solubilize agarose completely. For >2% gels, increase incubation time.
4. After the gel slice has dissolved completely, check that the color of the mixture is
yellow (similar to Buffer QG without dissolved agarose).
If the color of the mixture is orange or violet, add 10 l of 3 M sodium acetate,
pH 5.0, and mix. The color of the mixture will turn to yellow.
The adsorption of DNA to the QIAquick membrane is efficient only at pH 7.5.
Buffer QG contains a pH indicator which is yellow at pH 7.5 and orange or violet at
higher pH, allowing easy determination of the optimal pH for DNA binding.
5. Add 1 gel volume of isopropanol to the sample and mix.
For example, if the agarose gel slice is 100 mg, add 100 l isopropanol. This step
increases the yield of DNA fragments <500 bp and >4 kb. For DNA fragments
between 500 bp and 4 kb, addition of isopropanol has no effect on yield.
Do not centrifuge the sample at this stage.
Protocol
Protocol
QIAquick Spin Handbook 07/2002
6. Place a QIAquick spin column in a provided 2 ml collection tube.
7. To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column, and centrifuge for 1 min.
The maximum volume of the column reservoir is 800 l. For sample volumes of more
than 800 l, simply load and spin again.
8. Discard flow-through and place QIAquick column back in the same collection tube.
Collection tubes are re-used to reduce plastic waste.
9. (Optional): Add 0.5 ml of Buffer QG to QIAquick column and centrifuge for 1 min.
This step will remove all traces of agarose. It is only required when the DNA will
subsequently be used for direct sequencing, in vitro transcription or microinjection.
10. To wash, add 0.75 ml of Buffer PE to QIAquick column and centrifuge for 1 min.
Note: If the DNA will be used for salt sensitive applications, such as blunt-end ligation
and direct sequencing, let the column stand 2­5 min after addition of Buffer PE,
before centrifuging.
11. Discard the flow-through and centrifuge the QIAquick column for an additional 1 min
at 13,000 rpm (~17,900 x g).
IMPORTANT: Residual ethanol from Buffer PE will not be completely removed unless
the flow-through is discarded before this additional centrifugation.
12. Place QIAquick column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.
13. To elute DNA, add 50 l of Buffer EB (10 mM TrisCl, pH 8.5) or H2O to the center of the
QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 min. Alternatively, for increased
DNA concentration, add 30 l elution buffer to the center of the QIAquick membrane,
let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min.
IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the QIAquick
membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 48 l
from 50 l elution buffer volume, and 28 l from 30 l.
Elution efficiency is dependent on pH. The maximum elution efficiency is achieved
between pH 7.0 and 8.5. When using water, make sure that the pH value is within
this range, and store DNA at ­20°C as DNA may degrade in the absence of a
buffering agent. The purified DNA can also be eluted in TE (10 mM TrisCl, 1 mM
EDTA, pH 8.0), but the EDTA may inhibit subsequent enzymatic reactions.
Fyzikální mapování genomů
- přístup volen podle velikosti a komplexity genomu
Základní strategie
* restrikční (makrorestrikční) mapování
* kontigové mapování (seřazení souvislých sekvencí
genomu)
* přímé sekvencování DNA
Základní strategie pro mapování a sekvencování velkých genomů
Shora dolů
Zdola nahoru
Štěpení RE
elektroforéza
hybridizace
Genomová knihovna
Uspořádání klonů
Srovnání klonů
Restrikční mapování srovnáním jednoduchého a dvojitého štěpení RE
8
8
6
6
3
3
RE2
Restrikční mapování
kružnicových molekul
1. Linearizace molekuly
2. Značení na koncích
3. Izolace nejdelšího fragmentu
a jeho částečné štěpení RE1 a
RE2
4. Elektroforéza, stanovení
velikosti fragmentů a sestrojení
mapy
Restrikční mapování klonovaného fragmentu
Poloha BamHÍ´
1120 + x = 2860 (nový fragment
vzniklý štěpením BamHI)
x = 1740
Příklad restrikční mapy DNA fága lambda
Konstrukce restrikční mapy DNA genomu metodou dvojitého
štěpení
Restrikční místo = místo štěpení DNA restrikční endonukleázou
Restrikční mapa = fyzikální forma mapy vyjadřující vzdálenost RE míst,
která je dána velikostí fragmentu DNA mezi dvěma sousedními RE-
místy
Metoda: 1. elektroforéza v agarózovém nebo polyakrylamidovém
gelu
2. stanovení pozice fragmentů v gelu a jejich velikosti
3. izolace (eluce) fragmentů z gelu
4. štěpení izolovaných fragmentů další restriktázou
5. hledání překryvů mezi fragmenty, vzniklých působením
dvou nebo více restriktáz.
Příklad: Vzorek DNA o velikosti 5 000 bp je štěpený dvěma restriktázami (A a B)
B1 2500 A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3
A1 2200
1900 1900
A2 1400
B2 1300
B3 1200
A3 900 900 900
800 800
600 600
A4 500 500 500
300 300
Fragmenty štěpené restriktázou
B A
Mapa DNA genomu štěpeného restriktázami A a B
A3=900 A1=2200 A2=1400 A4=500
900 300 1900 600 800 500
900 300 1900 600 800 500
B3=1200 B1=2500 B2=1300
Příklady z mapování DNA pomocí restriktáz
1.
a) restriktáza SfiI (S)
Označení primárního
fragmentu
S1 S2 S3 S4 S5
Velikost primárního fragmentu
(bp)
4 100 2 300 1 900 1 200 300
Velikost sekundárního
fragmentu (bp)
3 300
800
2 100
200
1 800
100
700
500
300
b) restriktáza RsaI (R)
Označení primárního fragmentu R1 R2 R3 R4
Velikost primárního fragmentu
(bp)
3 500 3 100 2 300 900
Velikost sekundárního
fragmentu (bp)
3 300
200
2 100
700
300
1 800
500
800
100
2.
a) restriktáza ClaI (C)
Označení
primárního
fragmentu
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7
Velikost
primárního
fragmentu (bp)
3 500 2 500 2 100 1 400 1 000 400 100
Velikost
sekundárního
fragmentu (bp)
3 500 2 200
300
1 900
200
800
600
1 000 400 100
b) restriktáza Bam HI (B)
B2Označení primárního
fragmentu
B1
úplné
štěpení
částečné
štěpení
B3 B4
Velikost primárního
fragmentu (bp)
3 800 3 500 2 500 1 200
Velikost sekundárního
fragmentu (bp)
3 500
300
2 200
800
400
100
2 300
2 200
1 300
1 200
800
500
400
100
1 900
600
1 000
200