Hybridizace nukleových kyselin 1. Přenos DNA na hybridizační membránu (Southernův přenos) Southernův přenos (Southern blotting) je široce užívaná analyticá metoda původně vyvinutá Southernem (1975). Jednotlivé fragmenty DNA, obvykle vzniklé po štěpení restrikčními endonukleázami se rozdělí pomocí gelové elektroforézy a potom jsou přeneseny na inertní nosič (nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu). A. Příprava gelu pro kapilární přenos 1. Agarozový gel obsahující rozdělené reštrikční fragmenty DNA se po obarvení v ethidiumbromidu a vyfotografování ponoří do roztoku 0,25 M HCl (5-10 násobný objem) a inkubuje se za mírného třepáni 15 minut při pokojové teplotě. Dochází k depurinaci DNA a tím k fragmentaci restrikcích fragmentů na kratší úseky, které se snadněji přenášejí. Tento krok může být vynechán, jsou-li přenášeny fragmenty menší než 5 kb. 2. Roztok HCl se nahradí stejným objemem denaturačního roztoku (0,4 N NaOH - 0,6 M NaCl) a gel se inkubuje 30 min při pokojové teplotě za mírného třepáni. 3. Denaturační roztok se nahradí neutralizačním roztokem (1,5 M NaCl - 0,5 M TRIS.C1, pH 7,5), v němž se gel inkubuje dalších 30 min za mírného třepáni. B. Příprava membrány pro přenos DNA z gelu (při práci s membránoua papírem Whatman pracujeme v rukavicích) 1. Ustřihneme membránu přesně o velikosti gelu, namočíme ji v deionizované vodě a poté přeneseme na 15 min do roztoku lOxSSC (1,5 M NaCl - 0,15 MNa3Citrát). 2. Připravíme můstek (tj. 3 pruhy filtračního papíru Whatman 3) pro přenos pufru z rezervoáru na gel. Velikost můstku se řídí rozměrem gelu a použitého zařízení pro přenos. Můstek se poté podle nákresu přiloží na podpůrné sklo, na můstek se přiloží další 2 filtrační papíry Whatman a celé se namočí do roztoku lOxSSC. Do rezervoáru se naleje 1-2 1 roztoku lOxSSC. Po namočení (1 min) se pipetou (válcovitým pohybem) odstraní vzduchové bubliny mezi jednotlivými vrstvami filtračního papíru. 3. Na můstek se položí gel po neutralizačním kroku a odstraní se vzduchové bubliny. Doporučuje se položit gel hladkou spodní stranou, která byla na podložce, nahoru, aby případné nerovnosti na horní straně nesnížily účinnost přenosu. 4. Okraje gelu se obloží parafilmem nebo potravinářskou polyetylénovou folií, aby se zamezilo falešnému nasávání pufru okolo gelu. 5. Na gel se přiloží membrána a popisovačem se označí polohy jamek a orientace membrány (membránu přiložit pokud možno napoprvé, po přiložení neodlepovat z gelu). 6. Na membránu se položí 2-3 vrstvy filtračního papíru Whatman o velikosti gelu a dále pak vrstva savého materiálu (např. 10 cm vysoká vrstva buničité vaty), zatíží se sklem a závažím o hmotnosti asi Ikg. 7. Přenos probíhá 16-24 hodin; podle potřeby je možné doplňovat roztok lOxSSC v rezervoáru a měnit vrstvu buničité vaty. 8. Po ukončení přesávky odstraníme buničitou vatu a filtrační papír a membránu sejmeme. 9. Mmebránu ponoříme na 30 sec do 0,4 M NaOH. Zajistí se tak kompletní denaturace imobilizované DNA. 10. Membránu přeneseme do neutralizačního roztoku (0,2 M Tris.Cl [pH 7,5] - 2xSSC). 11. Membránu mírně (nikoli úplně) osušíme na filtračním papíru a ozáříme 3 min na transiluminátoru (strana obsahující přenesenou DNA směřuje k UV lampám). 12. Membránu můžeme nechat uschnout nebo pokračujeme hybridizací. Hybridizace DNA se značenou sondou A. Neradioaktiktivní naznačení DNA digoxigeninem. 1. Stanoví se koncentrace templátové DNA, určené k přípravě sondy. Připraví se 15 |Lil roztoku DNA o koncentraci 0,5-3 ug/ml. 2. DNA se denaturuje 10 min při 100°C ve vodní lázni a rychle se zchladí na ledě (chladící směs led/NaCl). 3. Připraví se směs pro značení DNA (v Eppendorfově zkumavce) na ledě se přidá: - 2 (0.1 směsi hexanukleotidů (směs náhodných oligonukleotidů - primerů) - 2 |il směsi dNTP a Dig-dUTP - 1 |Ltl Klenowovy polymerázy 4. Obsah zkumavky se krátce zcentrifuguje a inkubuje přes noc při 37°C 5. Reakce se zastaví přidáním 2 ul 0,2 M EDTA 6. Naznačená DNA se vysráží přídavkem 2,5 ul 4M LiCl a 75 ul 96% EtOH (vychlazený na -20°C). Dobře promíchat a ponechat 30 min při -70°C nebo 2 hod při -20°C. 7. Zcentrifugovat 15 min při 12 000 g, promýt 70% EtOH, osušit 96% EtOH, rozpustit v 50 ul TE pufru. 8. Uchovávat při -20°C. B. Hybridizace (Uvedené objemy roztoků jsou vypočteny na 100 cm3 memebrány). 1. Membrána se prehybridizuje ve 20 ml hybridizačního roztoku při 68°C nejméně 1 hod. (vysycení míst na membráně, na něž není navázána DNA). 2. Hybridizace při 68°C v 10 ml hybridizačního roztoku s přídavkem sondy (10-100 ng DNA/ml roztoku). 3. Promytí membrány (odstranění nespecificky navázané sondy) - 2 x 5 minut při pokojové teplotě (asi 100 ml roztoku 2xSSC - 0,1% SDS) - 2 x 15 minut při 68°C (asi 100 ml roztoku 0,lxSSC - 0,1% SDS) C. Imunologická detekce navázané sondy (Všechny reakce se provádějí při pokojové teplotě) 1. Membrána se promyje 1 min promývacím roztokem (0,1 M Kys. maleionová - 0,15 M NaCl - 0,3% Tween20, pH7.5) 2. Membrána se inkubuje 30 minut v blokovacím rotzoku (0,1 M Kys. maleionová - 0,15 M NaCl - 1% blokovací reagens) 3. Anti-Dig konjugát (zásobní koncentrace 750 U/ml) se rozpustí v blokovacího roztoku (objem podle velikosti membrány) do konečné koncentrace 150 mU/ml. Membrána se v tomto roztoku inkubuje 30 min. 4. Membrána se promyje promývacím roztokem 2 x 15 minut a poté se přenese na 2 minuty do detekčního roztoku (100 mM TRIS.C1 - 100 mM NaCl - 50 mM MgCl2). 5. Barevná reakce: Membrána se umístí do polyetylénového sáčku nebo do vhodné vany. Přidá se 5 ml detekčního roztoku obsahujícího 22,5 ul NBT a 17,5 ul X-fosfátu a sáček se ponechá bez třepáni ve tmě. K barevné reakci dochází během 30 minut (lze ponecht 12 hod). 6. Reakce se zastaví ponořením mebrány do TE pufru (membránu udržujeme vlhkou pro případnou rehybridizaci). 7. Membrána se vyfotografuje a vyhodnotí. Aparatura pro Southernuv přenos: (1) miska s lOxSSC, (2) skleněná podložka, (3) "můstek" ze 3+2 listů papíru Whatman 3 MM (3 listy jsou namočené do rezervoáru, 2 listy jsou pouze na horní ploše), (4) gel, (5) rámeček z Parafilmu, (6) 3 listy papíru Whatman 3 MM, (7) buničitá vata, (8) sklo, (9) závaží 1 kg. membrána Princip značení sondy digoxigeninem a kolorimetrické detekce DIG random primed DNA labeling 9- DIG Immobilized target nucleic add (e.g. Southern or Northern Bkrt) Klenow dNTPmix+ O-dUTP 9 9 9 9 9 9 Hybridization DIG-labeled probe Binding of anti-OIG-AP of O^ robe J- J_ X Ý Ý i Coforimebie detection with NBT and X-phosphate Diagram jednotlivých reakčních kroků při hybridizaci DNA se sondou značenou digoxigeninem Reakce Teplota Čas Reagent Prehybridizace 68° C 1 - 6 hod hybridizační pufr Hybridizace 68° C 8 -16 hod hybridizační pufr + sonda Post-hybridizační promytí 20° C 2x 5 min 2XSSC - 0,1% SDS Post-hybridizační promytí 68° C 2 x 15 min 0,lxSSC-0,l%SDS ekvilibrace membrány 20° C 2 min pufr BI blocking 20° C 30 min pufr B2 navázání protilátky 20° C 30 min 150 mU anti-DIG AP v B2 promytí 20° C 2 x 15 min pufr BI + 0,3% Tween 20 ekvilibrace 20° C 2 min pufr B3 barevná reakce 20° C 5 min - přes noc barvící roztok zastavení reakce 20° C 5 min TE pufr fotografování odstranění navázané sondy a rehybridizace odbarvení 50 - 60° C 2x1-2 hod dimethylformamid promytí 20° C 2 min redest, voda odstranění sondy (denaturace) 37° C 2 x 20 min 0,2M NaOH - 0,1% SDS neutralizace 20° C 2 min 2xSSC prehybridizace a hybridizace s další sondou II o n O-p-O-P-O-P-0 I 1 I O' O" 0" x4 Ü+ Molekula DIG-dUTP