Sekvencování DNA

*    stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury)

       Sekvencování  / Sekvenování 
                                         ??

      Sequencing     /          -

die Sequenzierung  /         -



*      používají se 2 metody:

  --   Chemická (Maxamova-Gilbertova)

  --   Enzymová (Sangerova)

  

*      společný rys obou metod: příprava a separace fragmentů DNA, jejichž velikost se liší o 1
nukleotid



                         Základní požadavky pro úspěšné stanovení sekvence:

                                  Chemická metoda (Maxam-Gilbert)

   Sekvence je odvozena z koncově značené molekuly DNA, která se chemicky degraduje v místech, kde
se vyskytuje báze určitého typu na fragmenty.

   Ty se následně oddělují elektroforézou.

                                    Enzymatická metoda (Sanger)











                             Enzymová metoda sekvencování DNA (Sanger)



                                    Automatické sekvencování DNA

                                  Asymetrická PCR pro sekvencování

                                    Strategie barevných primerů

                                  Strategie barevných terminátorů



                               Příklad fluorescenčního znační primerů

                           Vícenásobné detekce u různě značených primerů

                                        Genetický analyzátor
                                              ABI 3100

                                          Příklad výstupu

                            Genomové centrum zabývající se sekvencováním

                                        Sekvencování genomů

V praxi je velice často potřeba stanovit sekvenci fragmentu DNA, který je delší než průměrná délka
500 -- 1 000 bází dosahovaná v jedné reakci.

K tomuto účelu sekvencování genomů mohou být zvoleny dvě zcela odlišné strategie:

  -- náhodné sekvencování

  -- uspořádané sekvencování sousedních úseků

                                    Náhodné sekvencování genomů

*      Při náhodném sekvencování genomu jsou nejdříve připraveny mechanickým stříháním  genomové DNA
fragmenty s optimální velikostí (1 300 -- 2 000 bp) a po úpravě jejich konců jsou nahodile
naklonovány do vhodného vektoru za vzniku velkého počtu klonů.

*      Ke štěpení DNA se využívá sonikace nebo pankreatická DNáza I za přítomnosti Mn2+.

*      Předpokládá se, že celková informace o sekvenci obsažená v připravených malých klonech
odpovídá původní DNA a sekvence fragmentů jednotlivých klonů se vzájemně překrývají.

*      Pomocí univerzálních sekvenačních primerů připojujících se k vektoru poblíž klonovacího místa
jsou stanoveny sekvence krátkých úseků na koncích klonovaných fragmentů (minimálně 500 bází).

*      Stanovené sekvence jsou pak použity k uspořádání klonovaných fragmentů z jednotlivých vektorů
do souvislých sekvencí genomové DNA - kontigů.



                                        Náhodné sekvencování

                                      USPOŘÁDANÉ SEKVENCOVÁNÍ

  --    Pro doplnění sekvence mezer zbývajících po náhodném sekvencování

  --    Pro sekvencování malých fragmentů DNA



*       Dva odlišné přístupy:

  --    procházení primerem

    *    vyžaduje znalost sekvence, ke které se připojuje primer, který umožní prodloužení řetězce
    DNA-polymerázou.

    *    získaná sekvence z první reakce je použita pro návrh primeru pro další reakci a tento krok
    se opakuje, dokud není dosaženo kompletního stanovení sekvence.

    *    Tento proces nevyžaduje další klonování a minimalizuje stanovení nadbytečných sekvencí, ale
    správnost stanovené sekvence by měla být ověřena sekvencováním obou řetězců.

  

  --    postupné zkracování fragmentu exonukleázou a tvorba sousedících delecí



                                  Metody uspořádaného sekvencování

                                         DOKONČENÍ PROJEKTU

*      Sestavení kontigů





















*      Anotace (bioinformatika): ORF, repetice, regulační oblasti, (r) geny, (r) funkce