Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA • oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100°C), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (fbrmamid, močovina) • změna v uspořádání baží při denaturaci zvyšuje absorbci světla při vlnové délce 260 nm (hyperchromní efekt) Renaturace • opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing") podmínek • nastává při pomalém ochlazování (65°C) roztoku teplem denaturované DNA • nenastává při prudkém ochlazení roztoku DNA s vyšší teplotou než Tm • při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA • rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Denaturace a renaturace (hybridizace) DNA o to rvi (0 o c (0 -C s- o « ™ c > ra o 0£ denaturovaná jed no řetězcová DNA 60 70 80 Teplota (°C) 30 Čas (min) Stanovení hodnoty Tm Teplota, při které dochází k denaturaci DNA závisí na obsahu guaninu a cytozinu v DNA. Cím více obsahuje GC-párií, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Rozmezí denaturačních teplot je zhruba 30 - 100 °C. Denaturaci DNA provází hyperchromní efekt, tj. dochází ke zvýšení absorbance ultrafialového světla. Hyperchromní efekt je způsoben rozpadem dvouřetězcových molekul DNA na molekuly j ednořetězcové, které absorbují UV-záření silněji než molekuly dvouřetězcové. 1,2 1,1 A,Vfir, = absorbance roztoku DNA při t>25°C. &l?n = absorbance roztoku DNA pri t = 25 C. 260 Absorbance je stanovena pri 260 nm. 50% molekul DNA zdenaturováno teplota roztoku DNA 25 30 40 50 60 T 70 80 Tm 90 (OC) Teplota, při níž zdenaturoválo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se symbolem Tm. Tato teplota odpovídá inflexnímu bodu denaturační křivky. V definovaném roztoku napr. piati, že Odtud Tm = 69,3 + 0,41 (GC). GC= rm •**■* 0,41 Hybridizace molekul nukleových kyselin. Spojení částečně nebo úplně komplementárních DNA řetězců pocházejících z různých dvou řetězcových molekul DNA nebo podobně spojení DNA-řetězce s RNA řetězcem; oba procesy probíhají in vivo a mohou být navozeny in vitro. Hybridní molekuly DNA. Renaturované molekuly, v nichž se spojily řetězce pocházející z molekul DNA různých zdrojů Homoduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou. Heteroduplex. Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou. 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' 3' CTAGCTAGCTAGCTAG 5' zvýšení teploty 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' + přidání 3' CTAGCTAGCCGGCTAG 5' ochlazení 5 ' GATCGATCGATCGATC 3' 3' CTAGCTAGCCGGCTAG 5' Faktory ovlivňující tvorbu hybridů • teplota • koncentrace solí • stupeň komplementarity • délka fragmentů Využití hybridizace nukleových kyselin • test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat j en ty, které jsou dostatečně komplementární) • detekce molekul DNA a RNA, které j sou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině • základem hybridizace je vždy značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Uspořádání hybridizačního experimentu je rozmanité podle povahy prostředí, ve kterém probíhá HYBRIDIZÁCE NK V ROZTOCÍCH NA FILTRECH V ELEKTRONOVÉM IN SITU MIKROSKOPU KOLONIÍ A PLAK TEČKOVÁ PŘESÁVKY Z GELU (BLOTTING Y) I SOUTHERNŮV BLOTTING - DNA NOBTHERNO VÝ BLOTTING - RNA WESTERNOVÝ BLOTTING - PROTEINY Typy přenosu z gelu na membránu podle typu analyzovaných molekul • Southernův přenos - DNA • northernový přenos - RNA • westernový přenos - proteiny • southwesternový přenos - proteiny vázající DNA (sondou j e DNA) • northwesternový přenos - proteiny vázající RNA (sondou j e RNA) Tečková hybridizace („dot blot") Postup: • sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA • denaturace • vzorky DNA naneseny na podložku v podobě teček • hybridizace se sondou • hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, ß-spektrometrem) - o o o o o o o @ Typický hybridizační experiment -Southernův přenos (blot, přesávka) • technika vyvinuta E.M. Southernem (1975) • běžné použití při detekci přítomnosti určitých genů v buněčné DNA nebo při sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů Southernův blot (přesávka) - postup • rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou • denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting" -přesávka) • inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou - dojde k hybridizaci sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru • odmytí nenavázané sondy • detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie) stoh papírových ručníků (A) neznačená DNA rozštěpená reštrikční nukleázou (O nitro cel u I o sova membrána odstraněni n itrocel u losového papíru s pevně navázanou DNA značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ELEKTROFORÉZOU NAAGAROSOVÉM GELU mycí houba alkalický roztok ODDĚLENÉ FRAGMENTY DNA PŘENESENY NA NITROCELULOSOVOU MEMBRÁNU ZNAČENÁ DNA-SONDA JE HYBRIDIZOVANA S ODDĚLENOU DNA zalepený plasticky sáček označená DNA-sonda v pufru OZNAČENA DNA-SONDA HYBRIDIZOVANA S KOMPLEMENTÁRNÍMI PRUHY DNA JE ZVIDITELNĚNA AUTORADIOGRAFIÍ (E) proužky značených standardů značené proužky z pokusu Typy sond • reštrikční fragmenty dvouřetězcové DNA (cDNA) • mRNA izolovaná z buněk nebo tkání • RNA transkripty in vitro • syntetické oligonukleotidy (připravené podle sekvence aminokyselin) Způsoby značení sond • pomocí náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling") • posunem j ednořetězcového zlomu („nick translation") • koncové značení • značení vektoru s nakloňovanou sondou • značení transkriptů in vitro (RNA) Značení DNA pomocí náhodných oligonukleotidů „Random primer DNA labeling" .r a1 —/ ds Pa/A XUOAX 3>__rrtm rtrm ■r + «^P-cťMTP AUUUJAJUU - 3 wrtfnrrtr rmrrxrrmr využi 1/ ŕiŕLíMXťtene 2>tfA jaJco Ý\ubr\dt\Z>OL&Y\\(M Some Značení DNA posunem jednoretezcoveho zlomu „Nick translation" ŽI I I I I I I I 1JJ_LLLUjl 1 c/sDaJA rrm niimiiimi 12 1 n 11; 11 n 11 n n 111 * (V^T poffsn z ferne/ /?&./? rag/čl. m m 11 rrm 2Ly7-*A/^ i/ MlliMUlHlHHMlIl Značení konců DNA fragmentů a) značení 5 'konců ß /£3i. . « /^\ „ B 5' (Bv%ß ©LA* (P P „S 4 US* WSW ý» - Tk-MA- 0. ort 31 OH +f j> * í>H Značení konců DNA fragmentů b) značení 3' konců c,rS 5 ■ 3" Av.4 -/>*/yt*era'^ £ (Jccď*JQ\x/} Neradioaktivní značení sond Digoxineninem Biotinem fluorescenčními značkami (fluorescein, rhodamin. kumarin) "°y^Y0yť*Y° C-OH O Detekce neradioaktivně značených nukleových kyselin __________________digoxigeninem__________________ náhodné heHanukleotidy Lineární denaturovaná DNA dATP, dCTP, dGTP, dTTP +Dig-dUTP * /**!**•%■ ±x jW-w- 4-Z syntéza znaéené DNA hybridizace na filtru I detekce navázané sondy 1 | o \Ü$'Ar> Způsoby presávky („blotingu") • kapilární přenos • elektroforetický přenos • vakuový přenos Kapilární přenos ZÁVAŽÍ FILTRAČNÍ PAPÍR FILTR GEL S -1_—!-_-_—_ti PŘENOSOVÝ PUFR Vakuový přenos VÝVÉVA FILTR Hybridizační postup 1. Prehybridizace - zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu (Denhardtův roztok, BLOTTO, heparin, heterologní DNA, mléčné proteiny - blokovací reagent) 2. Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68°C, 42°C s formamidem) - lze volit různé podmínky hybridizace („stringence") Hybridizační postup 3. Promývání - odstranění nenavázané sondy (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) 4. Detekce navázané sondy - autografie - imunologická reakce - barvení - luminiscence -fluorescence Hybridizační postup 5. Rehybridizace - odmytí navázané sondy - aplikace další sondy Hybridizace s radioaktivně Hybridizace s neradioaktivně značenou sondou značenými sondami