feciborciloř ytokinetiky Biofyzikálni úslov AVČR, ßRNO fc-^B-^H V4 Ifil J [WJ =tl sil J J 14H : 131 III wtEE fga živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd. Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání nap myš, krysa, křeček nebo opic, člověka) avců jako je RIMÁRNÍ KULTURY - buňky získané přímo z živočišných tkání, kousek tkáně, nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění nežádoucích částí, omezená doba kultivace, specifické požadavky BUNĚČNÉ LINIE - adaptované na dlouhodobý růst in vitro diploidní - karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly izolovány ezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený tzv. "life-span" í - karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá kultiva< Udržují se tzv. pasážováním - určitý počet buněk se po určité době přenes heíeroploicln tvého živného prosifsdí ^•T, iERENTNI kultury - rostou přichyceny k pevnému podkladu (kultivační PENZNÍ kultury - nevyžadují podklad, rostou volně v médiu Hlavní komerční dodavatelé buněčných linií The American Type Culture Collection (ATCC) httD://www.atcc.com/ ■A2780 ■pri human ■ľ/sí;.' ovary Btorpŕio/ng;. epithelial mub 'are Methods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding ■at 3-6 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. ■fed/u/r. RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). WLdry Not specified Wescription: The A2780 human ovarian cancer cell line was established from I tumor tissue from an untreated patient. Cells grow as a monolayer and in suspension in spinner cultures. A2780 is the parent line to the cisplatin resistant cell ne A2780 cis (ECACC catalog no. 93112517) and the adriamycin resistant cell Iline A2780 ADR (ECACC catalog no. 93112520). |Shipped on dry ice 2780cis fpecies: human issue: ovary Jiorphology: epithelial Eubculture Methoch Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:5 to 1:20 i.e. seeding I at 1 x 103 to 1 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. Keils will attach slowly after resuscitation and take up to 7 days to reach conflu- lency. Recommendation: resuscitate cells in media without cisplatin. Add after (subculture of attached cells. im: RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamine + 1 u.m cisplatinum + 10% Fetal I Bovine Serum (FBS) (cisplatinum only necessary every 2-3 passages). karyotype: Modal no. 46 wescription: This cisplatin-resistant cell line has been developed by chronic exposure of the parent cisplatin-sensitive A2780 cell line (ECACC catalog no. 193112519) to increasing concentrations of cisplatin. A2780cis is cross-resistant Ito melphalan, adriamycin and irradiation. An increased ability to repair DNA damage as well as cytogenetic abnormalities has been observed. In order to retain resistance cisplatinum has to be added to the media every 2-3 passages. In addition to this matched pair of drug-sensitive/resistant cell lines an adri- amycin-resistant cell line, A2780adr (ECACC catalog no. 93112520), has been isolated from the same parental line A2780. Shipped on dry ice | A431 ecies: human sue skin tMorphology: epithelial ISubcu/ture Method' Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. l/Wed/urn. EMEM (EBSS) + 2 mM L-Glutamine + 1% Non Essential Amino Acids (NEAA) + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). iKaryory,'..!. Hyperthploid Wescription Derived from an 85 year old female with epidermal carcinoma. The cells carry large numbers of EGF binding sites and is an indicator cell for anti-TGF binding. Shipped on dry ice____________________________________________________ 85090402 Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti - sterilní Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků buněk v termostatu s řízenou atmosférou - 37° C, 95% vlhkost, 5% C02. Nutná přísná sterilita!!!! - sterilní roztoky, plastik, nádobky, sklo, pipety atd., sterilizace autoklávem (120 °C), nebo horkým vzduchem (180 °C) Práce ve sterilní. p BioHazard - lární proudění vzduchu, filtry -chrání i uživatele - práce s nebezpečnými viry apod.) je balancované chemické prostředí - zdroj pro energii a Základní mé biosyntézu Doplňky: c koňské) b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) ■■ specializované podle ložkv - zvířecí séra nejdražší součást média - ze zvířat z ekologicky málo poškozených oblastí vhodné definované náhrady sér ........a a antimykotika penicilín + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům) kultivační herentní (přisedlé) buňky - uvolnění od podkladu a rozvolnění shlu enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média. Některé buňky vyžadují tzv. feeder layer - vrstvu buněk inaktivovaných zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů buněk Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo v miskách různé velikosti. Velkokapacitní kultivace - na mikročásticích ve velkých kontejnerech -automatická výměna média Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 °C - mraznice, tekutý dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) - většinou dimetylsulfoxid nebe glycerol. Zmrazovaní je pomalé (řízené po 1 °C), rozmrazování rychlé -ponoření ampulí do lázně 37 °C. Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci a objasňování mechanismů r účinků buněčných regulátorů a genů, které určují individuální aspekty chování buněk. Tato technologie umožnila pokrok ve virologu, somatické buněčné genetice, endokrinológii, toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve výzkumu karcinogeneze a stala se významným nástrojem vývojové biologie, komplexní tkáňové fyziologie a průmyslové výroby specifických buněčných produktů. Výhody: lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku humorálních faktorů i celkového stavu organismu lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách logenita, re p rod u kováte I n ost a množství materiálu umožňuje studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů chování těchto buněk specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství důležitých biologických látek (enzymy, hormony) - hybridomy etické hledisko - systém omezuje využívání laboratorních zvírat Nevýhody: umělý zjednodušený systém poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in viv čně diferencované) Bunky nezrale (nediferencované nebo č; ► buňky kmenové (toti- nebo pluripotent ► buňky progenitorové Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do zralejších stá Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro některé tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky). Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách. jíí. Buňky zralé - diferencované Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou schopny se dále dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní buňky apod.) Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo se z nk vytvářejí heteroploidní permanentní linie Buněčné populace in vitro Imortalizované nádorové linie DUňky B3 nacrfeejí v ruznýcn fázíc ilmiiisrairaira synchronní ■ buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu chemie - uměle navozené různými 1LfSUllWlI»]ll[»I»[SJ|l||B»>U] při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi buněčného cyklu v praxi v nádoroyé terapii (Jéčba cytostatiky) ŘEVNI BUNKY imární - z krve nebo kostní dřeně člověka a labora detekce jednotlivých typů a počtů na hemocytom kultivace progenitorů in vitro - BFU-E, CFU-S, GM-Ci podmínky a specifické růstové faktory (erytropetii Využití při transplantacích ■ ■ namnožení buněk 'zadují specifické permanentní linie - z krve leukemických pacientů nebo lab. zvírat HL-60 - lidská promyelocytární leukémie - promyelocyty schopné diferencovat in vitro - bipotentní, deficientní v p53 kys. retinová (RA), DMSO - diferenciace do granulocyi vit. D3., forbol ester (TPA), butyrát - diferenciace do monocytů-makrofágů Vhodný model pro ► studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy myeloidních buněk ► studium příčin leukemických poruch ► studium účinků kyseliny arachidonové (AA), eikosanoidu a cytokinu (TGF-ß a TN Fa) Při diferenciaci se mění morfologie buněk (mikroskopická detekce na preparátech z cytocentrifugy) stoupá aktivita specifických enzymů (např.nespecifické esterázy) stoupá exprese specif, povrchových antigénu (CD11b, CD 14) - FCL vzniká schopnost fagocytózy a produkce kvslíkovvch radikálů (měření redukce NBT nebo chemiluminiscenčně) U937 - promonocytární leukémie - promonocyty schopné diferencovat do monocytů po RA, DMSO, TPA, mutovaný p53 ML 1 - lidská myeloidní leukémie - normální (wild type) p53 EPITELIALNI BUNKY Jíl si apoptozy epitelu střeva gmgaiansrna z adenokarcinomu kolonu - linie HT29, CaCQ2, HCT115 - nádorové buňk - FHC - fetální střevo - nenádorové. Schopnost diferencovat in vitro po působení butyrátu sodného (NaBt)-. růst aktivity alkalické fosfatázy ► morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu ► výšení exprese adhezívních molekul - E-kadherini Vhodný model ► pro studium regulace prolif., r vzniku nádorů kolonu pro studium účinků nenasyc. MK a cytokinů Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné •atinocyty - linie HaCaT - normální buňky s aktivním v a citlivé k působení cytokinů jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), linie nádorových bi" hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty ► geneticky modifikované buněčné líni pro detekci dioxinové aktivity (H4IIELuc) pro detekci estrogenní aktivity (MCF-7, MVLN) studovaných lá. Vnesený gen s luciferázou - intenzita odráží aktivaci příslušných utroDunecnýcri receptoru (AnR necc a le detekovaná na Jurruriorrietru VYBAVUJ] LABORATOŘÍ PFiö XULTJVACR BUjxJLX MAU LT. ► Sterilní prostředí- speciální plastik, sklo, pipety (skleněné, automatické -různé obi autokláv, horkovzdušná sterilizace M 30 oC) ► Klimatizace, UV světlo ► Destilační přístroj na superčistou vodu ► Laminární box (Biohazard) - laminární oroudění vzduchu terilní prostředí pro práci, od.. nkubátor - 37 oC, 5% C02, 95% vlhkost ► Počítač částic (buněk) ^ Inverzní mikroskop hfcirm pri prsici ► ELISA reader ► Cytocentrifug ► Fluorescenční mikroskop ► Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměn ► Průtokový cytometr (FACSCalib lasery, 4 fluorescence, sortovací modui stanovení několika parametrů současně u rozsáhlých buněčných populací rotory) Bockíon Dickinson ŕJuDS'feíjr— rnuííífunkcnj prístroj - spektrofotometr, fJuorirne r. minome ► Zařízení pro molekulární biologii Výkonná výpočetní technik^ Řada druhů podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se kompletní tekutá, koncentráty, prášková - skladování 40 C Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 jiS a chemikálie nejvyšší čistoty. Nutná sterilizace přes filtr 0,2 jim. Základní složkv: Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin - zdroj energie a uhlíľ" Aminokyseliny - zdroj energie a dusíku í'ryfcií'í Lipidy - esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod. Anorganické soli - zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor °ufrační solné směsi - Earlův roztok (fyziológ, roztok s vysokým obsahei vlaHC03) - kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5% CO zabraňuje rozpadu a alkalizaci média. Požadované pH většinou 7,2 - 7,4 - úprava HCl a NaOH Otevřený systém - Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěren Optická kontrola - indikátor fenolová červeň Organické pufrační systémy - HEPES 20mM ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČft, ARNO Cell Culture Media Classic Media: Media Formulations kpMI-1640 Medium omponent ^ORGANIC SALTS I Calcium Nitrate • 4H20 Magnesium Sulfate (anhydrous) Potassium Chloride I Sodium Bicarbonate Sodium Chloride Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) ■amino acids L-Arginine L-Asparagine (anhydrous) L-Aspartic Acid I L-Cystine • 2HCI L-Glutamic Acid L-Glutamine Glycine L-Histidine Hyd roxy-L-Pro line L-lsoleucine L-Leucine L-Lysine • HCl L-Methionine L-Phenylaianine L-Proiine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine • 2Na • 2H20 L-Valine 1 VITAMINS D-Biotin Choline Chloride Folic Acid myo-Inositol Niacinamide p-Amino Benzoic Acid D-Pantothenic Acid (hemicaicium) Pyridoxine • HCl Riboflavin Thiamine • HCl Vitamin B,2 D-Glucose Glutathione (reduced) Phenol Red • Na L-Glutamine Sodium Bicarbonate R 0883 [1x] g/L 0.1 0.04884 0.4 2.0 6.0 0.8 R 1145 [10x] g/L R 1383 R 6504 g/L R 8758 [Ix] g/L 1.0 0.1 0.1 0.1 0.04884 0.04884 0.04884 0.04884 4.0 0.4 0.4 0.4 — 6.0 — 2.0 60.0 6.8 6.0 6.0 8.0 0.8 0.8 0.8 0.2 2.0 0.2 0.2 0.2 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 0.0652 0.652 0.0652 0.0652 0.0652 0.02 0.2 0.02 0.3 0.02 0.02 — 0.3 0.3 0.01 0.1 0.01 0.01 0.01 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 0.04 0.4 0.04 0.04 0.04 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.15 0.015 0.015 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 0.03 0.3 0.03 0.03 0.03 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 0.005 0.05 0.005 0.005 0.005 0.02883 0.2883 0.02883 0.02883 0.02883 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.003 0.0002 0.003 0.003 0.003 0.003 0.001 — 0.001 0.001 0.001 0.035 0.35 0.035 0.035 0.035 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 0.00025 0.0025 0.00025 0.00025 0.00025 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.0002 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 0.000005 0.00005 0.000005 0.000005 0.00000 2.0 20.0 — 2.0 2.0 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 0.0053 0.053 0.0053 0.0053 0.0053 0.3 0.3 at 1x — — — — 2.0 at 1x 2.0 2.0 — VbwII VoUILUic iVlcUld Classic Media: Media Formulations Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) Component INORGANIC SALTS Calcium Chloride • 2H20 Ferric Nitrate • 9H20 Magnesium Sulfate (anhydrous) Potassium Chloride Sodium Bicarbonate Sodium Chloride Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) AMINO ACIDS L-Arginine • HCl L-Cystine • 2HCI L-Glutamine Glycine L-Histidine • HCl • H20 L-lsoleucine L-Leucine L-Lysine • HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine • 2Na • 2H20 L-Valine VITAMINS Choline Chloride Folic Acid myo-inositol Niacinamide D-Pantothenic Acid (hemicalcium) Pyridoxal • HCl Pyridoxine • HCl Riboflavin Thiamine • HCl OTHER D-Glucose Phenol Red • Na Pyruvic Acid • Na ADD L-Glutamine Sodium Bicarbonate Sodium Phosphate D 5523 g/L 0.265 0.0001 0.09767 0.4 6.4 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 0.004 0.004 0.0072 0.004 0.004 0.004 0.0004 0.004 4.5 0.0159 D 5546 [1x] g/L 0.265 0.0001 0.09767 0.4 6.4 0.109 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 D 5648 g/L 0.265 0.0001 0.09767 0.4 3.7 6.4 0.109 0.084 0.0626 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 D 5671 [1x] g/L 0.265 0.0001 0.09767 0.4 6.4 0.109 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 D 5796 [1x] g/L 0.265 0.0001 0.09767 0.4 3.7 6.4 0.109 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.0072 0.0072 0.0072 0.0072 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 — 0.004 — — 0.004 — 0.004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.004 0.004 0.004 0.004 1.0 1.0 4.5 4.5 0.0159 0.0159 0.0159 0.0159 0.11 0.11 — — 0.584 3.7 3.7 Animal Sera Product Testing for Fetal Bovine Sera F 2442 F 0643 F 3885 F 4135 F 3018 F 0392 SOURCE bovine bovine bovine bovine bovine bovine | COUNTRY STERILITY USA / USA / USA / USA / USA USA 1 / 1 PERFORMANCE / / / • / / / / / / / 1 CLONING ASSAY VIRUS (raw material) MYCOPLASMA BACTERIOPHAGE ENDOTOXIN (EU/ml) HEMOGLOBIN (mg %) / • 1 / 1 / / 1 <10 <20 3.0-4.5 N/A <10 <20 / <10 ==20 / N/A N/A f <10 <20 <10 <20 <10 <20 TOTAL PROTEIN (g %) 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 ELECTROPHORECTIC PATTERN igG HORMONE TESTING / N/A / N/A N/A N/A N/A Report result N/A Report result 6.7-8.0 Report result 6.7-8.0 N/A 6.7-8.0 N/A 1 6.7-8.0 1 pH at RT 6.7-8.0 6.7-8.0 OSMOLALITY (mOsm/Kg H20) 260-340 / 260-340 260-340 260-340 260-340 260-340 1 CHEMICAL ANALYSIS N/A / / N/A N/A 1 / — Indicates testing is performed and product meets specification. | ciborcileř ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČR, BRNO ■l D U ľ Průtoková (flow) cytometrie: jedna z hlavníc používanýcL metodolo uj oboratory ytokinetics Inslilule of Biophysics, ßrno Academy of Sciences Czech Republic DETEKCE PROLIFERACNI AKTIVITY BUNĚK vysetí určitého počtu - růstové spektrofotometrické stanovení celkových proteinů doba zdvojení populace (doubling time), rační doba (trvání buněčného cyklu) gen - Amido black Metabolickv aktivní část oooulace izotopové metody - stanovení podílu populace syntetizující DNA - inkorporace 3H- tymidinu do DNA - detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo scintilačně detektor ß záření spektofotometrické metody - inkorporace bromdeoxyuridinu - detekce pomocí navázané protilátky - ELISA reader nebo průtoková cytometrie (FCM) metoda redukce MTT na formazan - založeno na aktivitě mitochondrií Stanovení mitotického indexu mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných rátech Detekcepoi Flow cytometrie - procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi Stanovení délkv fází buněčného cvklu -' OMMjgltljJglJglMM^JjNW Testv cvtotoxi MTT test Stanovení viabil í trypanovou modří nebo eosine Detekce aooDtózv/nekrózv Morfologicky -světelný mikrosko Fluorescenční mikroskop Flow cytometrie (AnnexinV, TUNEL, subG0/G1 populace) TRYPAN BLUE DIAGRAM I STANDARD HEMOCYTOMETER CHAMBER ■he circle indicates the approximate area covered at 100x (microscope magnification (10x ocular and 10x objective), nclude cells on top and left touching middle line (O). Do not count cells touching middle line at bottom and right (0). Count 4 corner squares and middle square in both chambers (one chamber represented here). DIAGRAM II CORNER SQUARE (ENLARGEMENT) É5- «■ S =9= W zBz S O ó Z Count cells on top and left touching middle line (0). Do not count cells touching middle line at bottom and right (0). ytokinetiky fyzikálni ústav AVČA, MINO ► Na počátku stojí pracovní hypotéza, kterou ověřujeme ► Důležité jsou časové a koncentrační závislosti (dose-response) ► Studium působení jednotlivých faktorů nebo jejich kombinací (multivariační analýzy) ► Souvislost proliferace, diferenciace a apoptózy na buněčné úrovni ► Po stanovení základních cytokinetických dat studium detailnějších mechanismů účinků na subbuněčné a molekulární úrovni ► Experimenty se opakují nezávisle nejméně 3x (v případě nejasností i vícekrát) a v mnoha případech zahrnují ještě paralelní měření, která upřesňují získanou hodnotu. ► Výsledky jsou vždy statisticky zhodnoceny a je určena významnost rozdílů. ► Výsledky jsou prezentovány formou tabulek, grafů nebo reprezentativních obrázků či fotografií. Příklady výsledku s využitím buněčných linií _f\j J y .f o X C « 8. S ^ 1200-1 1000 800 600 4 400-200- 0 - ^ 11 ii win i 0.00 0.01 i im i i i mm 0.10 1.00 100-1 80 60-| 40-20- i i mm i i mihu i i '"hu 0.00 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (nM) (Log10 scale) PRO: 0 »aM PRO: 10 nM 0> '•5 © S £ o ° O v© «.s E s 8 2 *- S o ° 120 100 80 H 60 40 A 20 0 - -j | i i i mm i i i mm i i 1111111 0.00 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (nM) (Log10 scale) ........ PRO:5nM PRO: 15 UM FIGURE 2. The effect of all-/räns-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) on the studied cell parameters expressed as model predictions (lines) supplied with experimental points representing the means of 3-10 independent experiments. NBT = nitroblue tetrazolium. Figure 1. Effects of various doses of PIROX (squares), NDGA (circles), or ESCUL (triangles) on 3H-thymidine incorporation (% of nontreated control) in HS578T and U937 cells after 24 h (open symbols) or 72 h (solid symbols) cultivation. The data are means ± S.E.M. for 3-4 independent experiments performed in six parallels. vyjádření v % kontroly (neovlivněná populace=100%) CONCENTRATION (10-6 mol ciborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni ústav flVČH, ARNO ------- NDGA ESCUL 3H-thymidine incorporation (9c of nontreated control) in HS578T and U937 cells subjected to different treatment. The nonirradiated cells or cells irradiated with 1 or 5 Gy were cultivated in the presence of 25 ^mol/1 NDGA. 25 /xmol/1 ESCUL (inserts 3 b) or 50 /imol/1 ESCUL or without the agents (-------) for 72 h. Data are means ± S.E.N. for three independent experiments performed in six parallels. * p < 0.05; ** p < 0.01 significance of the interactive component ikólní Oslov nVČR, BRNO ■ MM •o at "5 2 o a» .a £ 3 c 1200 1000 - 800 - 600- 400 200 - 0 S + -H CH cell number ceil viability h--i 0 0.5 5 10 15 30 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 .5 > concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 1. Growth and viability of HT-29 cells after 120-hour-treatr ;nt 1 th TNF-a. P<0.05 versus untreated control; (*) Tukey or (+) LSD tet iborator kinetiky Biofyzikálni „stav fIVČfl, ARNO A2780 CO > '> V. 3 CO "ČĎ Ü 120 -i 100 - Cisplatin: IC50 = 1.34nM IC90 = 6.17mM LA-12: IC50 = 0.22 pM IC90 = 1.00 mM CO > > 3 co 0 o 0.01 0.1 1 10 100 Concentration [u.M] 1000 120 -i A2780CÍS Cisplatin: IC50 = 24.23 liM IC90 = 48.07 nM 100 - A LA-12: IC50= 1.40 liM IC90= 2.65 mM 80 - r V 60 - 40 - 20 - y 0 - • O Cisplatin \ LA-12 \ ----------1-----------------1-------------^n---------- —i* • i 0.01 0.1 1 10 100 1000 Concentration [uM] Fig. 2. Time- and dose-response effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 \xM and 256 (xM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC90) are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. oborcitor ytokinetiky Aioryslhólnf ústav I1VČA, HANO YBUNECN A2780 UNTREATED CONTROL CISPLATIN(5Q) LA-12(50) GG/G1: 43,5 ± 2.5 % S: 39.2 Sb 6.0 % G2/M: 17.3 ±5.5% GÖ/Gi: 21,6 ± 4.1 %<*) S: 35.2 ± 4.3 % .0 ± 5.5 % n G0/G1: 27.6 ± 3.5 %{*} S: 40.12 ± 7,4%{#) G2/M: 23.12 ± 5-4 %(#) 48 hr G0/G1: 71.2 ±6.9% S: 35,3 ±6.8% G2/M: 14.0 ±3.0% GC/G1: 45.5 ±6.4% S: 24,5 ± 6.3 % G2/M; 24.0 ± 6,7 % (•) G0/G1: 54.1 ±6.5% S: 29.8 ± 5.4 % G2/M: 21,32 ±1.5% 72 hr G0/G1: 71.2 ±6.9% S: 15-8 ±2.2% G2/M:8.2±1.3% G0/Gi:45.5±6.4%n Si 33.2 ±3.1 %0 G2iM:21.3x8.6% GQ/G1 :54,11t 6,5% D S: 29.3 ±3.4% f) G2/M: 16.6 ±3.2% U 937 HS 578 T O LJ 0 50 100 150 200 0 50 DNA FLUORESCENCE 100 150 200 Figure 2. Representative results of flow cytometric analysis of the cell cycles of U937 and HS578T cell lines after 24 h of cultivation. Cells were treated with 25 jumol/1 NDGA, 50 ^mol/1 ESCUL, or irradiated with 5 Gy. Esc ETYA vzsfípaxsEfíaitt^ fí&KRttSXÍ^^ G0G1 -phase ndga iSÄSSSSSQŕoaaaaaa^^ MK886 EtOH ÄSÄCmSÄWaö^ fflSraSQRH»HHHH»H^^ 20 40 50 Esc ETYA S-phase n°ga MK886 EtOH ■ ■Vi%V^V%V^V^\s\-A%^.M-< B=r taaaSSa^^^BSB-H ^^U^U^-ýA-.\-A-A^!4H 20 30 60 70 80 90 Esc ETYA G2/M-phase ndga MK886 EtOH DBM2 QBM2vJUN BBM2cJUN 30 40 50 60 Cell Number (%) Fig. 5. The effects of lipoxygenase inhibitors on cell cycle of BM2 cells expressing v-jun or c-jun. BM2, BM2vJUN and BM2cJUN cells were treated with zinc chloride and lipoxygenase inhibitors (5 \xM) or ethanol solvent (EtOH for 1 day. Harvested cells were fixed and stained with propidium iodide. DNA content in individual cells wa:. determined by flow cytometry. The bars represent the average values from three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. in. ytokinetiky zlkälní ústav AVČII, HANO O 0.5 5 10 15 30 concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 2. Cell cycle of HT-29 cells after 96-hour-treatment with TNF-a, (*) P<0,05 versus untreated control for Tukey test. Control ATRA 16 h 48 + 16 h 16 h 48 + 16 h TNF-a 0 n g/ml 5.4 % I----------1 V^w\_ TO 100 150 2O0 250 Q 50 100 130 200 230 9. 5.2 % 30 10O HO Z00 230 ru-Á TNF-a 10 n g/ml 24.5 % I-------1 7.3 % I-------1 ......... .. ■i-.-i so"" iód 15Ci" "zoo' ä a so iw i» ; 12.2 % I-----1 OMSO ' i6ó'' iib"" 2Íki» 16 h 48 + 16 h 96 + 16 h TNF-a 0 n g/ml í I----------1 4.2 % 30 100 130 200 230 FLZ-A 9.6 % I------1 iob ' 'lib FL2-A TNF-a 10 n g/ml *1 57.6 % I 1 L L K j* \ M ^SW-y*, A, 1 30 10 ) 130 200 pp. :30 : 44.4 % h 36.5 % I-----1 :u-vj 150 ' 2O0 250 o *r—.............nf 30 100 130 200 250 FU-A Fig. 2. Representative DNA content analyses (n = 3) for HL-60 cells treated with DMSO or ATRA. and TNF-a. Cells were stained and analyzed as described in Materials and Methods, y-axis, counts; *-axis, PI staining. Gates denote subdiploid fraction. BE P Interakce kys. arachidonové hexaenové(D pro-caspase-3 PARP Bax Bak Mcl-l control NaBt AA50 AA 50 - NaBt DHA 20 DHA 20 - NaBt kDa t*mm mm -"»«•»• «— 32 mm *• **------ 113 <------ 89 ##a#— «-» •Ä -•—• <—» . — w"m »• <------ 42 A2780 A2780cis (a) PARP 24 h 48 h 72 h (b) p53 24 h 48 h 72 h (c) O -Sf -„a, T T «* o o V "V ■■■■■.......nim. .I.IWIIII..[■)....... 113kDa 89 kDa 113kDa 89 kDa 113 kDa 89 kDa -••- #ÄJJI^ •*«• ~ 53 kDa 53 kDa 53 kDa A2780 A2780cis I s-n 3 m" w E3 3 > o .L w Kí i Q. tn ■Gľo O TT 5' Ľ. U! »S "o 3 g" g > p w to 24h 1 3.1i 0.8* 4.6i 1.4* 1.6i 0.1 2.3i 0.8' 24h i 6.2i 1.1* 8.2± L.0* 2.5 i 0.2* 2.8i 0.9* 48h 1 4.1± 1.4 6.8* 1.8* 2.6i 0.2 4.8± 1.9* 48 h L 6.8i j.y* 6.9i 0.2* 3.2i í). 5* 3.4i 0.6" 72h J 2.5± 0.6* 3.7i 0.7* 1.6i 0.2 2.5i 0.6* 72h 1 5.6± 2.0* 7.0i 2.8* 3.3 ± 0.8 3.3i 1.0 (d) ß -actin ••^•# 42 kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis cells (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to IC50 or IC^j concentrations of cisplatin or LA-12 and harvested at 24 hf 48 h, and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (/? < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) ß-actin (bottom panel). of Detekce buněčné < (aktivita alkalické fosfatazy, spektrofotometrie) ^70 000 ** O O 24 hours O 60 000 o o d48 hours ^5 50 000 x Ö) 40 000 d 72 hours ** o ^- o ** X 30 000 lO _L ** D ~l~ XX * >*20 000 l-L i > ** CB10 000 x XX * ** * XX -r _L Q_ _l < n **| n XX * * 0 NaBt H H H 3 3 3 5 5 5 TNF-« - 0.5 15 - 0.5 15 - 0.5 15 ytokinetics Detekce buněčné diferenciace (obsah F-aktinu FITC značený phalloidin- konfokální mikr.)