B7201 - Základy genomiky, cvičení 1
DEN 1
VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ K STUDIU GENOMU
ARABIDOPSIS THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN,
SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ
Úvod
Dopolední část bude věnována praktickému osvojení software pro design sekvence
oligonukleotidů OLIGO 6 včetně navržení sekvence PCR primerů, odpolední část zahrne vlastní syntézu,
purifikaci a kontrolu kvality PCR primeru.
Časový harmonogram
10:00 PŘÍPRAVA MATERIÁLU (Jan Hejátko), laboratoř 334
10:30 DESIGN SEKVENCE OLIGONUKLEOTIDU (Hana Konečná), místnost 211
12:30 OBĚD
13:30 SYNTÉZA OLIGONUKLEOTIDŮ (Hana Konečná, Renata Bendová), Centrální laboratoř 342
16.30 ukončení programu prvního dne
Příprava materiálu
Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky.
Práce v laboratoři
Bezpečnost
Zdroje vody
Základní chemikálie
Odměřování a pipetování
Skladování
Odpady a použitý materiál
Sterilizace
Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály:
ddH2O (sterilní, 50ml)
70% etanol / 100% etanol
Špičky/zkumavky (sterilní)
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 2
Komponenty PCR reakce
V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie:
Taq DNA polymeráza
10x koncentrovaný PCR pufr s MgCl2
dNTP
primery
Určení optimální sekvence PCR primeru na základě úseku DNA z Arabidopsis thaliana pomocí
programu OLIGO 6
Praktické seznámení se základnimi pojmy a menu na počítači
Aktuální oligo. Typy primerů (forward, reverse). Volná energie. Dimer versus duplex. Interní stabilita.
Vlásenky. Účinnost primeru. Terminální stabilita. Teplota tání Tm. Vložení sekvence úseku DNA
z Arabidopsis thaliana do databáze. Specifikace parametrů navrhované dvojice primerů, výběr optimální
dvojice pro PCR amplifikaci studovaného úseku DNA. Finální výstup v tištěné podobě přiložte
k protokolu.
Syntéza PCR primeru na syntetizátoru Expedite 8909
Vložení sekvence primeru do databáze. Výtisk Volba parametrů syntézy (ON vs. OFF, rozsah
syntézy), volba vhodné kolony, vlastní syntéza. Sledování účinnosti jednotlivých kroků syntézy (výtisk
histogramu přiložte k protokolu). Odštěpení produktu z kolonky amoniolýzou. Tepelná deprotekce.
Vakuové sušení v koncentračním systému Speedvac.
Purifikace primeru: Odsolení gelovou filtrací na molekulovém sítu
Odstranění nízkomolekulárních nečistot se provádí etanolovou precipitací nebo gelovou filtrací
na kolonce Sephadexu G-25. Pokud je pro některé aplikace nutné odstranit kratší nedosyntetizované
řetězce (např. pro antisense hybridizace), používá se purifikace na OPC (Oligonucleotide Purification
Cartridge). Nejúčinnějším, ale finančně nejnáročnějším způsobem čištění je HPLC.
Metoda 1A
Odsolení na CENTRI-SPIN 10 kolonce (Princeton Separations, Inc.).
Vysušený vzorek primeru rozpustíme v 50 l deionizované vody. Krátce necháme stát,
protřepeme příp. asi na minutu zahřejeme na 65 °C a nakonec krátce zcentrifugujeme.
Hydratace kolonky CENTRI-SPIN 10
Sklepat suchý gel do spodní části kolonky, otevřít horní zátku a nanést 650 l deionizované vody,
zavřít a asi 5 s třepat na vortexu. Poklepáním se ještě zbavit posledních bublin. Poté nejméně 30 min
nechat při pokojové teplotě probíhat hydrataci Sephadexu. Otevřít horní i spodní zátku kolonky a tuto
vložit do připravené mikrozkumavky bez víčka (wash-tube). Centrifugovat 2 min při 750g (odpovídá
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 3
2700 otáčkám na centrifuze Eppendorf 5415C). Po skončení centrifugace je v mikrozkumavce voda, tj.
odpad. Osušíme poslední kapky na kolonce. Ta je nyní připravena k vlastní aplikaci vzorku, která by
měla proběhnout během několika minut po skončení hydratace.
Vlastní odsolení vzorku
Kolonku vložte do mikrozkumavky s víčkem, víčko označte číslem skupiny (sample-tube) a
opatrně do centra gelu po kapkách naneste automatickou pipetou předem 50l připraveného vzorku.
Následuje centrifugace 2 min při 750g (2700 otáčkách). Po skončení centrifugace přidejte k odsolenému
primeru v mikrozkumavce 950 l deionizované vody, protřepte. Ve stojánku je připravena jedna
mikrozkumavka označená na víčku UV (pro měření výtěžku) obsahující .......l vody a jedna prázdná
označená QC (pro chromatografickou kontrolu kvality). Do UV mikrozkumavky přidejte ...... l
odsoleného primeru na měření absorbance a do QC mikrozkumavky napipetujte 50 l odsoleného
primeru.
Určení výtěžku.
Stanovení absorbance zředěného vzorku měřením při 260 nm (spektrofotometr HELIOS).
Definice jednotky OD. Výpočet výtěžku syntézy v jednotkách OD a převody do jiných jednotek. Výtisk
protokolu o syntéze s doplněným výtěžkem surového a odsoleného produktu přiložte k protokolu ze
cvičení.
Kontrola kvality.
Chromatografie na ionexovém perfúzním sorbentu Poros HQ 10 (Applied Biosystems).
Stručné seznámení s výhodami perfúzní chromatografie na přístroji BioCAD 700E (Applied Biosystems).
Výběr vhodné kolony a vhodné analytické metody. Manuální nástřik 20 l surového a odsoleného PCR
primeru. Porovnání chromatogramů. Výtisk obou chromatogramů ve zvoleném modu (Tile, Overlay)
přiložte k protokolu.
Úkoly
Doplňte následující protokol ­ pouze jeden pro dvojici
PROTOKOL
Číslo skupiny:
Jména:
Datum:
Úloha: SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ
Cíl: Seznámit se se současnými možnostmi při automatické syntéze oligonukleotidů, s dostupnými
modifikacemi a aplikacemi. Porozumět základním zásadám pro navrhování PCR primeru. Pochopit
základní princip syntézy oligonukleotidu a umět se zorientovat v jednotkách, ve kterých se vyjadřuje
výtěžek. Umět vysvětlit základní rozdíl v čistotě produktu po jednotlivých typech purifikací.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 4
Návrh sekvence primeru
Přiložte výstup ze software OLIGO 6, primery označte číslem skupiny, stručně zhodnoťte kvalitu
nalezených primerů.
Syntéza
Přiložte histogram ze syntézy a protokol ze syntézy s doplněným výtěžkem vyjádřeným v jednotkách OD,
g a v jednotce molární koncentrace.
Odsolení
Přiložte výstup z chromatografu obsahující chromatogramy surového a odsoleného vzorku. Jednou větou
zhodnoťte, zda je pozorovatelný rozdíl a vysvětlete.
Rozšiřující literatura dostupná v Centrální laboratoři
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987.
Aktuální verze ,,OLIGO", Primer Analysis Software. User Manual. Version 6, MBI, 2000.
PCR Primer, A Laboratory Manual. Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1995.
DEN 2
IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, PCR, PRÁCE S DATABÁZEMI
MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝCH INFORMACÍ
Úvod
Jednou z metod studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si
osvojíte rychlou metodu izolace DNA z rostlinného materiálu a založíte několik PCR reakcí.
Amplifikovat budeme úsek DNA pro použití jako sondu v pozdější hybridizaci a oblast inzerce cizí DNA
(transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21.
Časový harmonogram
8:30 Úvod k praktické části (Jan Hejátko)
9:00 IZOLACE DNA (Jan Hejátko)
10:00 DATABÁZE (Jan Hejátko)
12:00 OBĚD
13:00 ZALOŽENÍ PCR (Jan Hejátko)
14:00 DATABÁZE-dokončení (Jan Hejátko)
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 5
Přehled
Úvod k praktické části
ˇ Úvod do metodologie praktika
o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky
o schéma experimentu
o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homo-
nebo heterozygotní stav, vlastní provedení
Praktická část
1. Izolace DNA
2. Založení PCR
Metoda 2A
Rychlá izolace DNA pro PCR
1. Homogenizovat jeden střední list vychlazenou skleněnou tyčinkou v 1,5ml zkumavce
(eppendorfka) ve stojánku.
2. Přidat 400 l extrakčního pufru, vortexovat 5 s a nechat stát při laboratorní teplotě 60 min.
3. Centrifugovat při 14000 otáčkách 30 min, 4°C.
4. Přenést 300 l supernatantu do nové 1,5ml zkumavky a přidat 300 l izopropanolu, 4-6 krát
překlopit. Nechat stát 10 min při laboratorní teplotě.
5. Centrifugovat 20 min, 4°C. Odstranit supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu.
6. Přidat 500 l 70% etanolu. Centrifugovat při 14000 otáčkách 2 min. Odstranit etanol. Nechat vysušit
(SpeedVac, cca 10-15 min).
7. Pelet rozpustit ve 100 l sterilní ddH2O. Genomovou DNA uchovávat na ledu nebo v lednici.
Extrakční pufr
Tris/HCl (200mM, pH7.5)
NaCl (250mM)
EDTA (25mM)
SDS (0.5%)
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 6
Metoda 2B
Založení PCR
Do 0.5 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq
polymerázu podle schématu:
PCR směs: 10x pufr dNTP prim1 prim2 Taq pol. templ. DNA H2O celk. 50 ul
5 ul 4 ul 1 ul 1 ul 2 ul 5 ul 32 ul
primery AHP4 spec.: Sim612, Sim 799 ­ 212 bp
primery ARR21 spec.: 16kon, 16new ­ 340 bp
primery ARR4 spec.: ARR4N, ARR4S ­ 137 bp
primer transpozon 8130, Sim 799 ­ 250 bp
8130, 16new ­ 390 bp
d11, ARR4N ­ 195 bp
Navrhněte vhodnou kombinaci primerů a to tak, aby jste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni
identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo
heterozygotního pro danou inzerční alelu. Využijte schéma na straně 8:
Kombinace primerů pro jednotlivé typy templátů (viz také schéma na následující straně):
primery templátová DNA
AHP4
1a ......... .......... ............
2a ......... .......... ............
3a ......... .......... ............
4a ......... .......... ............
ARR21
1b ......... .......... ............
2b ......... .......... ............
3b ......... .......... ............
4b ......... .......... ............
ARR4
1c ......... .......... ............
2c ......... .......... ............
3c ......... .......... ............
4c ......... .......... ............
Na základě přiložených výsledků analýzy použitých primerů pomocí programu Oligo navrhněte vhodné
podmínky PCR pro dané reakce:
Cyklus: 94°C ......s
45 cyklů:
94°C .... s
58°C .... s
72°C .....s
72°C .... min
4°C 
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 7
Úkoly (příklad):
1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank
2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli
3. Určete nejbližší homolog cheY(E. Coli) u Arabidopsis pomocí algoritmů BLAST a FASTA.
4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis.
5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu
v publikované sekvenci daného chromosomu).
6. Vyberte si jeden gen z úkolu 4 a určete oblast 1000 bazí v oblasti promotoru genu. Ukončete sekvenci
na ATG. Analyzujte na přítomnost vazebních míst transkripčních faktorů pomocí hledání v databázi
TRANSFAC.
7. Srovnejte libovolné sekvence z Arabidopsis s homologií větší než 30% a menší než 100% pomocí
algoritmu CLUSTALW.
8. Vyhledejte nejméně jednu EST sekvenci Glu-6-P izomerázy (hledání homologie nebo podle
klíčového slova).
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 8
Šablona k protokolům: Izolace DNA a PCR
Jméno:
Datum:
Úloha:
Cíl:
Postup a výsledky:
Závěr:
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 9
DEN 3
IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU NA GELU, ZNAČENÍ SONDY
PRO HYBRIDIZACI, PŘENOS DNA Z GELU NA MEMBRÁNU
Úvod
Další způsob identifikace genů je hybridizace se značenou sondou. Ta je připravena z DNA
známé sekvence a označena tak, aby byla detekovatelná po navázání na homologní případně heterologní
sekvenci DNA, která je imobilizovaná na membráně. Ta se přenese na membránu z gelu spontánním
kapilárním sáním. Pokud se přenáší na membránu genomová DNA, mluvíme o metodě Southern blotting.
Ve cvičení připravíme agarózový gel umožňující elektroforetické rozdělení PCR produktů podle
velikosti. Z gelu přeneseme DNA na nylonovou membránu v alkalickém prostředí. Přítomnost specifické
DNA na membráně prokážeme hybridizací se sondou značenou alkalickou fostatázou zprostředkující
chemiluminiscenční signál.
Časový harmonogram
8:00 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA
9:00 STRUČNÝ ÚVOD K IDENTIFIKACI FRAGMENTŮ HYBRIDIZACÍ SE ZNAČENOU
SONDOU (Alena Kuderová, Markéta Pernisová)
10:00 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTŮ NA AGARÓZOVÉM GELU (Alena Kuderová, Markéta
Pernisová)
11:00 KAPILÁRNÍ TRANSFER (Alena Kuderová, Markéta Pernisová)
12:00 OBĚD
13:30 ZNAČENÍ SOND A HYBRIDIZACE (Alena Kuderová, Markéta Pernisová)
Přehled metod
1. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu
2. Detekce na UV transiluminátoru
3. Kapilární transfer (Southern blotting)
4. Přečištění PCR produktu
5. Určování koncentrace DNA
6. Značení sondy
7. Hybridizace
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 10
Metoda 3A
Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce.
1. Ve 250 ml láhvi svařit 100 ml 1x TBE pufru a 1,5 g agarózy. Po rozpuštění agarózy přidat 2 l
etidium bromidu, který bude sloužit k vizualizaci DNA.
2. Připravit formu pro gel, vsadit hřeben a nalít do formy vrstvu tekuté agarózy 5 - 8 mm. Nechat
ztuhnout.
3. Formu s gelem vložit do elektroforézové vany, zalít pufrem a vyjmout hřeben.
4. Napipetovat délkový a hmotnostní standard a vzorky:
ˇ délkový a hmotnostní standard (NEB): 10l (0,5 g)
ˇ vzorek: 10 l PCR (zbytek ponechat pro přípravu sondy) + 1 l nanášecího pufru
5. Spustit elektroforézu při 80 V po dobu 60 min (aby bromfenolová modř, která putuje s nejkratšími
fragmenty neopustila gel).
6. Pozorovat proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentovat; bude
později porovnáván se signály na hybridizační membráně. Tento gel bude použit pro Southern
blotting.
Délkový a hmotnostní standard: 100 bp DNA ladder (0,5 g)
Metoda 3B
Kapilární přenos v alkalickém prostředí
1. Po fotodokumentaci odstranit část gelu nad starty a pravý horní roh gelu. Dále změřit výšku a šířku
gelu. Gel umístit do vaničky s destilovanou vodou a krátce opláchnout.
2. Vylít destilovanou vodu, přidat až 10 objemů přenosového roztoku (1,5M NaCl/0,5M NaOH),
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 11
umístit na kývací platformu a míchat 30 až 40 min.
3. Během této doby sestavit aparaturu pro přenos DNA:
a. Přes čistou vaničku položit skleněnou desku.
b. Ustřihnout obdélník filtračního papíru Whatman 3MM takových rozměrů, aby po
přiložení přes skleněnou desku nepřesáhl šířku vaničky a zasahoval oběma užšími konci
až na dno vaničky. Toto je první vrstva knotu, který bude sát roztok.
c. Ustřihnout 3 obdélníky filtračního papíru Whatman 3MM takové velikosti, aby
přesahovaly výšku i šířku gelu asi o 1 cm na každé straně a další 3 obdélníky velikosti
gelu.
d. Nastříhat jednotlivé vrstvy buničiny o rozměrech gelu. Mělo by jich být tolik, aby po
zatížení byla jejich výška 7-8 cm.
e. Ustřihnout nylonovou membránu Hybond N+ velikosti gelu.
f. Naplnit vaničku přenosovým roztokem a část ponechat v petriho misce.
g. Smočit nejdelší filtrační papír Whatman 3MM a umístit na skleněnou desku. Pomocí
skleněné pipety nebo tyčinky se zbavíme všech případných bublin mezi sklem a papírem.
h. Smočit 3 větší filtrační papíry Whatman 3MM a postupně vrstvit do středu aparatury tak,
aby nevznikaly vzduchové bubliny.
i. Vyjmout gel z přenosového roztoku a přiložit opatrně vrchní stranou do středu vrchního
filtračního papíru; odstranit všechny vzduchové bubliny.
j. Opatrně umístit nylonovou membránu na gel (od středu ke krajům). Okamžitě vzniká
těsný kontakt s gelem. Při chybné manipulaci se nesnažit o opětovné umístění membrány
na gel­ v takovém případě použít novou membránu.
k. Smočit postupně poslední tři filtrační papíry Whatman 3MM a vrstvit je na membránu.
Odstranit případné vzduchové bubliny.
l. Nakonec přiložit vrstvu buničiny, zatížit suchou petriho miskou, kterou dále zatížíme
odměrnou baňkou naplněnou asi 200 ml vody. Nádobu zabezpečíme úchytkou na stojanu.
4. Zkontrolovat kontakt jednotlivých vrstev a pomocí proužků parafilmu umístěných těsně kolem gelu
zamezit nežádoucímu kontaktu vrstev. Tak se veškerý přenosový roztok může do horních vrstev
dostávat pouze přes gel a nebude ,,obtékat". V opačném případě by se účinnost a stejnoměrnost
přenosu snižovala.
5. Přenos nechat probíhat 4 hodiny, potom aparaturu rozebrat, membránu opláchnout v roztoku 2 x
SSC a nechat uschnout mezi dvěmi filtračními papíry. V alkalickém prostředí se mezi nylonovou
membránou a DNA vytvořily kovalentní vazby, a není proto nutné DNA imobilizovat dalšími
postupy.
Metoda 3C
Izolace PCR produktu z agarózového gelu pomocí komerční soupravy Qiagen
1. Na nový agarózový gel nanést 35l PCR směsi + 3,5l nanášecího pufru.
2. Po elektroforéze z agarózového gelu vyříznout daný proužek, aby bloček agarózy byl co nejmenší.
3. Určit jeho hmotnost.
4. Přidat 3x objem pufru QG (tj. 100 mg gelu ­ 100l QG).
5. Zahřát na teplotu 50°C po dobu 10 min nebo dokud se agaróza nerozpustí. Průběžně 2-3x promíchat.
6. Přidat 1x objem (gelu) izopropanolu, promíchat a vše dát do kolonky.
7. Centrifugovat při 14000 otáčkách 30s, odstranit protečený roztok.
8. Do kolonky přidat 750l pufru PE a centrifugovat při 14000 otáčkách 30s, odstranit protečený
roztok. Centrifugovat ještě jednou bez pufru. Kolonku umístit do čisté zkumavky.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 12
9. Na střed kolonky napipetovat 30l sterilní ddH2O, nechat stát 5 min při laboratorní teplotě a
centrifugovat 1 min.
Metoda 3D
Měření koncentrace DNA spektrofotometricky
1. V čisté zkumavce naředit DNA 100x v objemu 200l.
2. Do kyvety napipetovat 200l sterilní ddH2O, vynulovat absorbanci.
3. Odstranit vodu z kyvety, napipetovat naředěnou DNA a změřit absorbanci.
4. Vypočítat koncentraci podle vzorce: OD260 =1,0 => konc. DNA = 50ng/l.
Metoda 3E
Příprava značené sondy
1. Naředit DNA na koncentraci 10 ng/ul.
2. Umístit 10 ul této DNA do zkumavky a denaturovat 5 min ve vroucí vodě.
3. Okamžitě umístit DNA na led a 5 min chladit (po schlazení ­ asi 2 až 3 min. - rychle stočit, aby se
zkondenzovaná kapalina dostala na dno)
4. Přidat : 10 l reakčního pufru
2 l značícího činidla
10 l pracovní koncentrace ,,cross-linkeru" (činidla, které zprostředkovává kovalentní vazbu
enzymu na DNA).
5. Vše promíchat, stočit a inkubovat 30 min/ 37°C.
Sonda se může použít ihned nebo může být skladována na ledu 2 hodiny.
Metoda 3F
Hybridizace
1. Předehřát požadovaný objem hybridizačního roztoku na požadovanou teplotu (55°C);
objem pufru: 0,25 ml pufru /cm2
membrány.
2. Umístit membránu do hybridizačního válce s pufrem a prehybridizovat nejméně 30 min/55°C.
3. Přidat značenou sondu a hybridizovat přes noc.
Literatura
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987, 1st Volume, Preparation and
analysis of DNA.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 13
Úkoly
Vypracování protokolu: přiložit a popsat zdokumentované výsledky, zdůvodnit případné nejasnosti.
Šablona k protokolům: Kapilární přenos DNA a hybridizace se značenou sondou
Jméno:
Datum:
Úloha:
Cíl:
Postup a výsledky
Závěr:
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 14
DEN 4
FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA
Úvod
Cílem práce je určit velikost jednotlivých fragmentů DNA ze tří různých rostlin Arabidopsis
thaliana získaných PCR reakcemi se dvěma páry primerů a na základě této kvantifikace rozhodnout, zda
se jedná o divoký typ, homozygotní či heterozygotní rostlinu. Studenti provedou PCR reakce
s fluorescenčně značenými primery, z jejich produktů připraví vzorky pro fragmentační analýzu na
automatickém genetickém analyzátoru ABI PRISM 310, kvantifikují fragmenty a interpretují výsledky
analýzy.
V další části práce se studenti seznámí s možnostmi vícebarevného značení fragmentů při studiu
mikrosatelitů.
Časový harmonogram
9:00 PROMÝVÁNÍ MEMBRÁN PO HYBRIDIZACI (Alena Kuderová, Markéta Pernisová)
10:15 FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA (Eva Paděrová)
12:00 OBĚD
13:30 FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA (Eva Paděrová)
DETEKCE HYBRIDIZACE (Alena Kuderová, Markéta Pernisová)
Přehled
Automatický genetický analyzátor ABI PRISM 310 je založen na principu kapilární elektroforézy
fluorescenčně značených DNA fragmentů. Má využití jednak pro sekvenování DNA, jednak pro
fragmentační analýzu. Jednotlivé DNA fragmenty jsou elektroforézou v kapiláře rozděleny a postupně
detekovány laserovým detektorem.
Při fragmentační analýze připravíme fragmenty DNA PCR reakcí s jedním nebo několika páry
primerů, kdy jeden primer z každého páru je fluorescenčně značený. V průběhu jediného běhu pak
můžeme současně analyzovat několik různých fragmentů za předpokladu, že se navzájem liší svou délkou
nebo jsou označeny různými fluorescenčními barvami. Spolu s každým vzorkem běží interní délkový
standard, který umožní přesnou kvantifikaci jednotlivých fragmentů. Je možné využít až pět různých
fluorescenčních značek, přičemž pátá je pak vyhrazena pro délkový standard.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 15
Metoda 4A
Příprava fluorescenčně značených DNA fragmentů
Pro tuto úlohu využíváme genomovou DNA z rostlin Arabidopsis thaliana izolovanou v předchozích
dnech.
Pro každou z nich připravíme dvě PCR reakce .
Objemy pipetujeme do PCR zkumavek podle následujícího postupu:
5 ul dNTP mix
5 ul PCR buffer
2 ul Taq polymerasa
37 ul ddH2O
1 ul DNA
2,0 ul každý z primerů
Příklad dvojice primerů pro mutant AHP4
1. PCR zkumavka: Mutant AHP4 *Sim 799; Sim-612
2. PCR zkumavka: Mutant AHP4 *Sim 799; 8130
3. PCR zkumavka: WT *Sim 799; Sim-612
4. PCR zkumavka: WT *Sim 799; 8130
Příklad dvojice primerů pro mutant ARR21
1. PCR zkumavka: Mutant ARR21 *16new; 16kon
2. PCR zkumavka: Mutant ARR21 *16new; 1830
3. PCR zkumavka: WT *16new; 16kon
4. PCR zkumavka: WT *16new; 8130
Příklad dvojice primerů pro mutant ARR4
1. PCR zkumavka: Mutant ARR4 *ARR4N ARR4S2
2. PCR zkumavka: Mutant ARR4 *ARR4N d11
3. PCR zkumavka: WT *ARR4N ARR4S2
4. PCR zkumavka WT *ARR4N d11
Obsah protřepeme na Vortexu a stočíme na centrifuze.
PCR cykler nastavíme takto:
HOLD CYCLE HOLD HOLD
2 min 20 sec 30 sec 60 sec 8 min hold
94 C 94 C 57 C 70 C 72 C 4 C
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 16
Příprava vzorků pro genetický analyzátor
1. Do vialky určené pro analyzátor pipetujeme pro každého testovaného jedince:
0,5 ul PCR produktu u Arabidopsis
1.0 ul délkového standardu TAMRA 500
12 ul formamidu
2. Protřepeme na Vortexu.
3. Denaturujeme 3 min při 95 C.
4. Rychle zchladíme na ledu.
Fragmentační analýza na ABI PRISM 310
Analýzu provádíme na křemíkové kapiláře dlouhé 41 cm (efektivní délka 30 cm) za použití
polymeru POP4 na bázi polyakrylamidu. Vzorky umístíme do automatického dávkovače a vyplníme
seznam vzorků, pořadí nástřiků a parametry analýzy podle pokynů vyučujícího. Píky jednotlivých
fragmentů kvantifikujeme vzhledem k předem vyhodnocenému délkovému standardu.
Interpretace dat fragmentační analýzy Arabidopsis
Porovnáme velikosti jednotlivých fragmentů ze tří jedinců. Na jejich základě určíme, kdy se
jedná o heterozygotní či homozygotní rostlinu nebo divoký typ.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 17
Metoda 4B
Posthybridizační stringentní promývání
1. Předehřát primární promývací pufr na 60°C. Použitý objem: 2-5 ml/ cm2
membrány.
2. Opatrně přenést membránu do válce s tímto roztokem a promývat 4 x 5 min při 60°C.
3. Promývat 2 x 5 min druhým promývacím roztokem při laboratorní teplotě.
4. Membránu vložit do misky s druhým promývacím roztokem a nechat stát 10-15 min.
Chemifluorescenční detekce signálu za použití ECF substrátu
1. Membránu umístit na čistý neabsorpční povrch a napipetovat rovnoměrně po celém jejím povrchu
ECF substrát (25 l/ cm2
membrány); inkubovat 1 min.
2. Přiložit vrchní část detekční folie, odsát přebytek substrátu a zatavit.
3. Inkubovat ve tmě při laboratorní teplotě. První detekci provést přibližně po 2 hodinách.
Detekce chemifluorescenčního signálu
1. 0,5 h před detekcí zapnout STORM.
2. Na detekční plotnu přístoje kápnout trochu EtOH. Na toto místo přiložit folii s membránou (lépe
přilne k povrchu a eliminují se bubliny).
3. Skenovat pro chemifluorescenci při rozlišení 100 mikronů.
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 18
DEN 5
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FRAGMENTAČNÍ ANALÝZY.
Šablona k protokolům: Fragmentační analýza
Jméno:
Datum:
Úloha:
Cíl:
Postup a výsledky (s přiloženými spektry):
Závěr:
Určit, zda jde o homozygota či heterozygota a proč (zdůvodnit).
Verze: 20. 12. 2006
B7201 - Základy genomiky, cvičení 19
Verze: 20. 12. 2006