1 FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET ˇ FRET je Fluorescence Resonance Energy Transfer ­ Fluorescenční rezonanční energetický transfér ˇ podle objevitele Főrster nazýván také Förster Resonance Energy Transfer ˇ přenos energie mezi dvěma fluorofory vzdálenými 10-100 1. první fluorofor (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou 2. místo fluorescence je energie přenesena na druhý fluorofor (akceptor) 3. Akceptor vyzáří přijatou energii ve formě světla Podmínky: a) vzdálenost mezi molekulami je menší, než 100 b) emisní spektrum donoru se překrývá se absorpčním (excitačním) spektrem akceptoru c) molekuly mají stejně orientovány dipólové momenty FRET: schéma M 1 M 2 molekula 1 F1 F2 F1 F2molekula 2 F2 FRETFRET Základní vztahy ˇ účinnost FRET E je definována: ˇ kde 'D a D jsou fluorescenční časy vyhasínání v přítomnosti a bez přítomnosti akceptoru ˇ F´D a F jsou intensity fluorescence v přítomnosti a bez přítomnosti akceptoru Základní vztahy ˇ účinnost (E) závisí na vzdálenosti mezi donorem a akceptorem (r) ˇ R0 je Försterova vzdálenost při které je účinnost přenosu 50% ˇ R0 závisí na integrálu překryvu emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru (J) ˇ 2 je faktor zahrnující dipólové orientace, pro volně rotující molekuly je většinou 2/3 ˇ n je refrakční index, Q0 je kvantový výtěžek samotného donoru 2 FRET www.anaspec.com FRET www.anaspec.com Aplikace ˇ sledování strukturních a konformačních změn (dvě molekuly (případně dvě části molekuly) jsou označeny donorem a akceptorem a sledujeme zda dochází k výměně energie ˇ sledujeme: studium struktury proteinů, polynukleotidů, DNA, protein-protein interakce, DNA-protein interakce, atd. ˇ analytické aplikace Sledováni změn konformace molekuly ˇ např. sledování změn struktury proteinu, případně jiných biopolymerů ˇ nevýhoda: ovlivnění struktury navázáním fluoroforů F1F1 F1 F1 FRETFRET KONFORMACE 1 KONFORMACE 2 Sledování interakcí mezi vlákny DNA ˇ vzdálenost mezi vlákny DNA spojenými vodíkovými můstky je 30-60 ˇ na větší vzdálenosti: donor obsahuje Ln3+ Analytické aplikace FRET www.invitrogen.com 3 Analytické aplikace FRET Chemiluminiscence Chemiluminiscence ˇ zdrojem excitace je chemická reakce ˇ z reakce jedné molekuly ~ jeden foton A + B X* Produkt + světlo http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Chemoluminescent_reaction.jpg Příklad chemiluminiscenční reakce ­ oxidace luminolu kyslíkem Chemiluminiscenční reakce ˇ reakce luminolu v zásaditém prostředí s kyslíkem (peroxid, vzdušný kyslík) modře fluoreskující roztok ˇ jestliže jsou v roztoku obsažen také Fe2+, nebo Cu2+ (katalýza reakce) dochází k zvýšení intenzity luminiscence http://people.howstuffworks.com/luminol.htm Bioluminiscence ˇ celkem je známo asi 550 druhů organismů, které produkují luminiscenční světlo ˇ v roce 1887 profesor Duboise izoloval ze světlušek dvě látky: luciferin a luciferázu ˇ na zemi světélkují zejména brouci z čeledi Lampyriade (světlušky) a někteří kovaříci (např. Pyrophorus noctilucus) ˇ v moři bylo zatím objeveno přibližně světélkujících 250 druhů: medusy, chobotnice, krakatice, ryby, paryby, atd. ˇ bioluminiscence živočichů je vysvětlována různými důvody: hledání partnera (světlušky), lákání kořisti (např. ryba zubatka, některé druhy světlušek, žraloček brazilský ), zastrašení nepřátel (ryba stříbrnáč, medusy z čeledi klanonožců). 4 Světlušky... Luciferin Luciferin ˇ luciferin se za přítomnosti katalyzátoru luciferázy a oxiduje kyslíkem na oxyluciferin ˇ přeměna 1 molekuly luciferinu na oxyluciferin je doprovázena emisí 1 fotonu (namodralé světlo) ˇ u tohoto děje se 1 molekula ATP přemění na ADP ˇ u některých organismů je tzv. fotoprotein ­ kyslík, luciferin a luciferáza se nacházejí blízko sebe, ale teprve změna konformace fotoproteinu spustí chemickou reakci (,,aktivátorem" jsou většinou ionty Ca2+) Bioluminiscence medusy A. Victoria Většina mořských živočichů jevících bioluminiscenci emituje namodralé světlo (základem je oxidace luciferinu). U medusy Aequorea Victoria však byla pozorována zelenázelená luminiscence... ?? Bioluminiscence medusy A. Victoria ˇ medusa obsahuje protein aequorin, který se skládá s apoproteinu (apoaequorin) a prostetického proteinu (coelenterazine), který je podobný luciferinu ˇ v přítomnosti O2 a při vysoké hladině Ca2+ dojde k oxidaci coelenterazinu na excitovaný coelenteramid a CO2 ˇ relaxací coelenteramidu do základního stavu se uvolňuje modré světlo ( = 469 nm) ˇ uvolněné světlo může být absorbováno dalším proteinem obsaženým v těle medusy ­ GFP 5 ,,Green fluorescent protein" ˇ absorpční maxima GFP jsou 395 a 475 nm ~ může dojít k absorpci světla uvolněného z aequorinu ˇ absorbované světlo excituje GFP a dochází k vyzáření zeleného světla ( = 509 nm) Struktura GFP ˇ GFP byl objeven Shimamurou v 60. letech ˇ GFP obsahuje běžné aminokyseliny, ale ve slunečním světle jeví lehce nazelenalou fluorescenci (kolem 500 nm), stejně jako živá Aequorea Victoria v moři... Struktura GFP ˇ GFP vzniká cyklizací, dehydratací a oxidací vzdušným kyslíkem sekvence proteinu obsahujícím Ser-Tyr-Gly Tsien Y. R., Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:509­44. Fluorescenční vlastnosti GFP ,,Divoký" typ GFP ­ směs fenolového a fenolátového derivátu Hlavní excitační pík - 395 nm (emisní maximum - 508 nm) Minoritní excitační pík - 475 nm (emisní maximum ­ 503 nm) Použití GFP v chemii a biologii ˇ lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly), který má vlastnosti stejné jako ostatní proteiny, ale je mnohem lépe detegovatelný ˇ genové inženýrství ­ sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... GFK ­ Green Fluorescent Králík 6 Použití GFP v chemii a biologii ˇ nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) ˇ obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem ˇ sledování genové exprese ˇ medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Jiné varianty GFP - YFP -electronový ,,stocking" s dalším Tyr (tzv. class 4) 516 nm 529 nm zelenožloutlá luminiscence ­ YFP (yellow fluorescent protein) Jiné varianty GFP TYR je nahrazen indolem (tzv. class 5) 436 nm 476 nm modrozelená luminiscence, rozštěpení píků Jiné varianty GFP - BFP TYR je nahrazen imidazolem (tzv. class 6) 383 nm 447 nm modrá luminiscence ­ BFP (Blue Fluorescent Protein) Jiné varianty GFP BRET ˇ BRET: Bioluminescence Resonance Energy Transfer ˇ sledování interakcí v živých organismech ˇ možnost sledování interakcí (podobně jako FRET), ale alespoň jeden z fluoroforů se ve sledovaném organismu vyskytuje přirozeně 7 ElektroluminiscenceElektroluminiscence Elektroluminiscence ˇ materiál emituje světlo působením procházejícího proudu, nebo působením elektrického pole ˇ většinou se jedná o tzv. radiační rekombinaci (zánik páru díra-volný elektron) ˇ příklady elektroluminiscenčních materiálů: ZnS dopovaný Ag, nebo Cu Triboluminiscence Triboluminiscence ˇ při škrábání, drcení, nebo tření může dojít k přerušení asymetrických vazeb krystalu (cukr, diamant) ˇ náboj je po přerušení asymetrických vazeb nerovnoměrně rozložen ˇ při vyrovnání nábojů v krystalu dochází k luminiscenci Thermoluminiscence ˇ přírodní krystalické materiály obsahují poruchy v krystalické mřížce (např. obsahují volné ionty, které narušují elektrické pole krystalu) ˇ jestliže se vytvoří tzv. potenciálová díra v elektrickém poli, může se v ní usadit volný elektron (elektronová past) ˇ tento volný elektron může být excitován (vesmírné záření, radioaktivita) a v elektronové pasti může být jeho energie zachována i stovky, nebo tisíce let ˇ termoluminiscenční datování: zahříváním, nebo po ozáření silným světlem získá elektron v tzv. dlouhodobé elektronové pasti dostatek energie, aby se uvolnil ˇ uvolněná energie se měří ˇ vhodné pro datování látek, které byly v minulosti ozářeny ˇ nutná složitá kalibrace