Biologie vitaminu A a jeho úloha ve
fyziologii živočichů
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116
KAROTENOIDY
von Linting, 2006
- Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol,
retinal, kyselina retinová)
- Prekurzory retinoidů jsou karotenoidy, zejména -karoten (~ 50 z >400 je
využitelných)
- Nejdůležitejším derivátem je kyselina retinová (RA), odvozená od retinalu
- Tělo je přijímá v potravě, karotenoidy v rostlinné, vitamin A a jeho deriváty v
živočišné
RETINOIDY
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA ­ retinoic acid)
Retinol equivalent (RE) = retinol v potravě ( g) + -karoten ( g) + ostatní karotenoidy ( g)
6 12
RE u žen ~ 800 g na den
RE u mužů ~ 1000 g na den
STRUKTURY NEJBĚŽNĚJŠÍCH PŘIROZENÝCH RETINOIDŮ
Ross, 2000
- Resorbovány jsou v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění
na aktivní retinoidy (retinyl estery), s lipidy a dalšími lipofilními látkami tvořícími
chylomikrony jsou uvoněny do lymfatického systému odkud se postupně
uvolňují do celkového tělního oběhu. Zásoba je vytvářena v játrech (50-85%
celkového) v lipidových kapénkách ve hvězdicovitých buňkách jater.
- 90% retinoidů je v těle v podobě retinyl esterů v lipidové složce chylomikronů,
část jich může být i přímo v buněčných membránách.
- beta-karoteny mohou být uloženy navíc v tukové tkáni
- v případě potřeby (mobilizace zásob) je retinol uvolňován z jater do krve,
vázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázající
(binding) protein). Tento komplex (holo-RBP) se váže s transthyretinem (TTR,
prealbumin), čímž je zabráněno vylučování retinolu v ledvinách. Takto v
plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách.
- K přeměně na koněčné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby.
Retinoidy tedy působí zejména autokrinně a parakrinně.
Distribuce retinoidů v organismu
Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A
A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu
Ross, 2000
ÚLOHA RETINOIDŮ VE FOTORECEPCI
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA ­ retinoic acid)
MECHANISMUS REGULACE RŮSTU A VÝVOJE ORGANISMU RETINOIDY
V regulaci ontogeneze je klíčovým
retinoidem kyselina retinová ­ RA,
a to její izoformy all-trans a 9-cis.
Ross, 2000
McCaffery, 2000
Proteiny regulující účinky RA v buňce
a) Enzymy
Metabolismus retinoidů, zejména oxidace.
a) Retinoidy vázající proteiny
Zásoba v buňce, regulace jejich intracelulární koncentrace, transport.
a) Jaderné receptory RA (transkripční faktory)
Realizace transkripce na RA závislých i nezávislých genů.
Kyselina retinová (RA)
MORFOGEN & TERATOGEN
PLEIOTROPNÍ VLASTNOSTI
V průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro formování tělní osy
a segmentaci (Hox geny), vývoj CNS, očí, srdce, ledvin, pohlavních orgánů, a epitelů obecně.
U dospělců se pak podílí zejména na udržování homeostáze imunitního systému, epitelů a zrání
pohlavních buněk (spermatogenezi).
ENZYMY - I
Retinol dehydrogenázy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYD
Dvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významná
pro metabolismus retinoidů, oproti třídě IV, kterou lze detekovat v oblastech intenzivního
metabolismu retinoidů od 10 dpc. Pravděpodobně se ale uplatňují i membránově vázané
alkohol dehydrogenázy (známe 2 co oxidují retinol), upřednostňují však pouze 9-cis isomery.
ENZYMY metabolismu RA
ENZYMY - II
2) Retinaldehyd dehydrogenázy : oxidace RETINALDEHYDŮ -> KYSELINU RETINOVOU
Tato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízena
retinaldehyd dehydrogenázami. Byly identifikovány 3 typy, RALDH, které s liší specifitou
k retinaldehydům a distribucí v organismu.
RALDH1 (=AHD2, ALDH1) ačkoliv je relativně málo aktivní, je silně exprimován v retině, a tak
prakticky všechna RA v retině je produktem tohoto enzymu. Dále je během embryogeneze
exprimován ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgeny
a je možné, že tak zprostředkovává interakci mezi RA a androgenními jadernými receptory.
RALDH2 je vysoce selektivní k retinaldehydům. Začíná se exprimovat již v průběhu gastrulace
A odpovídá za produkci RA ve všech tkáních závislých na RA (mozek - zejména motoneurony,
mícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,...). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavření
nervové trubice a poruch ve vývoji srdce, přídavkem RA, lze tyto efekty potlačit.
RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům.
U časných embryí je exprimován ve ventrální části retiny a v gangliích koncového mozku
(telencephalon). Později je přítomen zejména v játrech a kůži. Společně s RALDH1 u embryí
katalyzuje přeměnu gamma-aminobutyraldehydu na GABA.
ENZYMY - III
CYP26 (=P450RAI) : oxidace KYSELINY RETINOVÉ -> KYSELINU 4-OXORETINOVOU
(Hydroxyláza kyseliny retinové, dvě formy CYP26A1 a CYP26B1)
CYP26 je členem velké rodiny cytochromů P450. V současné době je jediným známým enzymem
katabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně ve všech
buňkách s metabolismem RA a v buňkách citlivých k působení RA. Jeho podíl na deaktivaci RA
není však plně objasněno. Např. u žab, 4-oxoRA je silným aktivátorem receptorů RA a tak
i buněčných regulací citlivých k RA.
Je pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významem
než výše jmenovaní. Jejich exprese, podobně jako syntéza RA je v průběhu embryonálního
vývoje velice dynamická v závislosti na typu tkáně a vývojovém období. Obecně je souhra v jejich
expresi a aktivitě nezbytná pro segmentaci (zejména regulace Hox genů) vyvíjejícího se embrya.
Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních
(RARE-LacZ reportér)
RARE * LacZ
RAR RXR
RA
RA
RA
RA
Xn*
-galaktozidáza
X-Gal
X-Gal
X-Gal
X-Gal
X-Gal
*další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru
Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc)
A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2
B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
Detekce epxrese CYP26 (in situ mRNA hybridizace)
v retině (A) a RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
v embryonální retině (čelní a zadní pohled)(B)
13 dpc
2 ds postnatal
13.5 dpc 16 dpc
McCaffery, 2000
Ukázka stanovení LacZ na buněčné úrovni
Retinoidy vázající proteiny
1) Intracelulární
a) Buněčný retinol vázající protein (CRBP ­ cellular retinol binding protein)
Váže retinol i retinaldehyd a chrání je před oxidacemi a světlem. Retinol vázaný na CRBP-1
však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou. Uvolněný retinaldehyd
je pak přístupný pro oxidaci RALDH na RA.
b) Buněčný RA vázající protein (CRABP ­ cellular RA binding protein)
CRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, který je však přítomen
nejen v cytoplasmě, ale i v jádře, asociuje s receptory pro RA a slouží tak i jako transkripční
regulátor / kofaktor.
Je zajímavé, že absence CRBP a CRABP (knock-out myši) má minimální účinek na fenotyp
organismu, na rozdíl od vypnutí některého z enzymů (viz. výše) nebo receptorů (viz. níže).
2) Vázané na membránu
Megalin (gp330 / LRP-2) - patrří do rodiny LDL (low-density lipoprotein) receptorů.
Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a slouží jako receptor pro RBP
a retinol (a také sonic hedgehog (Shh)). Megalin zprostředkovává transport retinolu
(vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvy epiteliálních buněk, ale i do jejich intracelulárního
prostoru. V ledvinách se podílí i na transportu dalších lipofilních vitaminů (např vit. D + vit. D
vázající protein, vit. B12 + transcomalamin). Komplex ligand ­ megalin je pohlcen procesem
endocytózy a vzniklý endosom cestuje buňkou na místo určení.
Receptory RA
Receptor RA = RAR = retinoic acid receptor (RAR, RAR, RAR + isoformy)
RAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RA
Receptor retinoidu X = RXR = retinoid X receptor (RXR, RXR, RXR + isoformy)
RXR je aktivovaný pouze 9-cis RA
RA receptory patří do rodiny jaderných receptorů společně s receptory thyroidních hormonů,
receptorem vit. D, receptory aktivujícími peroxisomové proliferátory (PPARs), jaterním X
Receptorem (LXR), farsenoidovým receptorem (FXR) a se sirotčími (orphan) receptory. S těmi
zde jmenovanými RXR tvoří také heterodimery regulující transkripci mnoha ontogeneticky
významných genů.
Regulace genů řízených RA je zprostředkována jejími receptor, které zároveň slouží i jako
transkripční faktory. Vytvářejí funkční homo (RAR/RAR, RXR/RXR) i heterodimery (RAR/RXR),
přičemž heterodimery jsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsou
specifické pro konkrétní promotorové sekvence (response elements) v promotorech RA
indukovaných genů.
Příklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místy
Ross, 2000
Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD),
oproti vyřazení jednotlivých receprotů RAR nebo RXR
Obecně vyřazení jednotlivých isoforem receptorů (homozygoti -/- RAR1, RA2 nebo RAR2)
nemá žádný zásadní účinek na fenotyp takových zvířat. Po vyřazením jednotlivých subtypů, však
již můžeme pozorovat různé malformace a nedostatečnosti. Z RAR se jeví nejvýznamnější RAR.
Větší účinek má vyřazení RXR, které je způsobeno pravděpodobně jejich úlohou při vytváření
heterodimerů s ostatním jadernými receptory. RXR -/-, hyne 13.5-16.5 dpc, z důvodu
nedostatečně vyvinutého srdce, má také nedostatečně vyvinuté oči. RXR -/- je viabilní ale samci
jsou sterilní.
Ross, 2000
Interakce transkripční aktivity RA a některých drah transdukce signálu
Aktivní komplex RAR/RXR v mnoha případech působí jako represor v promotorech
rozpoznávaných také AP-1 (Jun/Fos komplexy) a Smad proteiny (TGF rodina).
Na druhou stranu, aktivita RA receptorů může být modifikována jejich fosforylací
na serinových a threoninových zbytcích serin/threonin kinázami. A to zejména MAPK
kinázami (Erk; JNK1,2,; p38), protein kinázou A (PKA) a na cyklinu H závislou cdk7.
Tyto postranslační modifikace RA receptorů vedou k další variabilitě v možnostech
regulovat RAR/RXR řízenou transkripci jak pozitivně, tak negativně a to i za nepřítomnosti
ligandu (RA). Modifikují, zejména interakce s dalšími proteiny transkripčního komplexu.
Některé fosforylace (např. p38 -> RAR) indukují degradaci daných receptorů)
Inhibice AP-1 zprostředkované
transkripce kyselinou retinovou
RXR / RXR
A/B DC FE
A/B DC E
LBD/AF-2DBDAF-1
LBD/AF-2DBDAF-1
EEIVPS74PPS77PPPLPR
EELVPS67PPS70PLPPPR
EEMVPSS66PS68PPPPPR
EEMVPSS77PS79PPPPPR
RAR1
RAR2
RAR2
RKRRPS369RP
RKRRPS362KP
RRRRPS360QP
RRRRPS371QPRAR1
RXR
SSSLNS22PTGR....S44P.. S48P.. S54P... SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP
Serinové a threoninové zbytky fosforylované () u RAR/RXR receptorů,
ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla)
AF-1 (A/B doména) ­ oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu
DBD (C doména) ­ DNA vázající doména (DNA-binding domain)
LBD/AF-2 (D/E doména) ­ oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu
PKAMAPKs + cdk7
JNK1 + JNK2
NN-
-C
-C
Literatura ke studiu
1. Clagett-Dame, M., and L. A. Plum. 1997. Retinoid-Regulated Gene Expression in Neural
Development. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 7:299-342.
2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and
Embryonic Development. Annu. Rev. Nutr. 22:347-381.
3. Maden, M., and M. Hind. 2003. Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule. Developmental
Dynamics 226:237-244.
4. McCaffery, P., and U. C. Drager. 2000. Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous
system: a master differentiation factor. Cytokine & Growth Factor Reviews 11:233-249.
5. McCarthy, R. A., and W. S. Argraves. 2003. Megalin and the neurodevelopmental biology of sonic
hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960.
6. Napoli, J. L. 1999. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism.
Biochimica et Biophysica Acta 1440:139-162.
7. Rochette-Egly, C., and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to
study the functional selectivity of RARs and RXRs in retinoid signaling. Histol Histopathol 16:909-922.
8. Ross, S. A., P. J. McCarffery, U. C. Drager, and L. M. De Luca. 2000. Retinoids in Embryonal
Development. Physiological Reviews 80:1021-1054.